ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח
Summary
שיטה שילוב של פלסמיד דנ"א לתוך תאים ברשתית Murine לצורך ביצוע או רווח או הפסד של מחקרים פונקציה<em> In vivo</em> מוצג. שיטה זו מנצל להגדיל את חולף על החדירות של קרום התא פלזמה המושרה על ידי יישום של שדה חשמלי חיצוני.
Abstract
אפיון פונקציונלי של גנים הביע במהלך התפתחות הרשתית יונקים עדיין מהווה אתגר משמעותי. ג'ין מיקוד ליצור הפסד או מותנה המכונן של knockouts פונקציה נשאר עלות עבודה אינטנסיבית, כמו גם זמן רב. הוספת לאתגרים אלה, הרשתית הביע גנים ייתכן תפקידים חיוניים מחוץ הרשתית המוביל בלבול מכוון בעת שימוש בגישה בנוקאאוט. יתר על כן, היכולת להביע ectopically גן ברווח של הניסוי פונקציה יכול להיות יקר מאוד כאשר מנסים לזהות את תפקיד מפרט תא גורל ו / או בידול סופנית.
אנו מציגים שיטה שילוב מהיר ויעיל של פלסמידים DNA לתוך הרשתית עכבר בילוד ידי electroporation. היישום של דחפים חשמליים קצר מעל כוח תוצאות מסוימות בתחום לעלייה זמנית בחדירות הממברנה הפלסמטית, להקל על העברת החומר על פני קרום 1,2,3,4. עבודתו פורצת הוכיח כי electroporation יכול להיות מנוצל כאמצעי להעברת גנים לתאי יונקים ידי גרימת היווצרות קרום הידרופילי הנקבוביות פלזמה המאפשר מעבר של DNA טעון דרך bilayer השומנים 5. הפיתוח הטכני רציף הביא לקיומה של electroporation כשיטה ב vivo העברת גנים ברקמות עכבר מרובים כולל הרשתית, השיטה המתוארת להלן 6, 7, 8, 9, 10.
פתרון ה-DNA מוזרק אל תוך החלל subretinal כך DNA ממוקם בין אפיתל הפיגמנט ברשתית הרשתית של העכבר (P0) בילוד ו פולסים חשמליים מוחלים באמצעות אלקטרודה פינצטה. מיקום רוחבי של העיניים העכבר מאפשר התמצאות קלה של האלקטרודה פינצטה את היישור הכרחי מוט ה-DNA הרשתית חיובי שלילי מוט. שילוב ביטוי נרחב של הגנים הועבר ניתן לזהות על ידי יום לאחר הלידה 2 (P2). בשל העדר ההגירה רוחבי משמעותי של תאים ברשתית, אזורים electroporated ולא electroporated נוצרות. Non-electroporated אזורים עשויה לשמש היסטולוגית בקרות פנימיות ובמידת הצורך.
Electroporation רשתית ניתן להשתמש כדי לבטא את הגן תחת מקדם בכל מקום, כגון החטיבה, או לשבש את תפקוד הגן באמצעות בונה shRNA או Cre-recombinase. ביטוי ממוקד יותר ניתן להשיג על ידי תכנון בונה עם היזמים תאים ספציפיים גן. ויזואליזציה של תאים electroporated מושגת באמצעות בונה bicistronic להביע GFP או על ידי שיתוף electroporating ביטוי של GFP לבנות. יתר על כן, בונה מרובות ניתן electroporated לחקר תופעות גן קומבינטורית או רווח והפסד בו זמנית של פונקציה של גנים שונים. Electroporation רשתית עשוי גם להיות מנוצל לצורך ניתוח של cis-הרגולציה אלמנטים גנומית ידי יצירת בונה ביטוי הולם מוטנטים המחיקה. ניסויים כאלה יכולים לשמש כדי לזהות cis-הרגולציה האזורים מספיק או נדרש ביטוי גנים ספציפיים תא 11. ניסויים אפשריים מוגבלים רק על ידי זמינות לבנות.
Protocol
Discussion
בשנת vivo electroporation מייצג שיטה מהירה ויעילה לטרנספורמציה של תאים ברשתית עם פלסמידים ביטוי ה-DNA. שיטה זו מאפשרת לבצע את הניסוי רווח של מחקרים לתפקד ectopically על ידי החדרת גן של עניין בשליטת היזם הביע בכל מקום בגוף או לבצע אובדן של מחקרים לתפקד באמצעות בונה shRNA מיקוד גנים ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי NIH R01EY020560-01 ועל ידי חוקר WM Keck יאנג פרס למחקר רפואי. המחברים מבקשים להודות יוסף Bedont עזרתו במהלך הדמיה של ההכנות זריקות הרשתית.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Buffer Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | N/A |
| Chloroform | J.T. Baker | 9180-03 | N/A |
| Sodium Acetate | J.T. Baker | 3470-05 | 3 M stock |
| Fast Green FCF | Fisher Biotech | BP123-10 | 10 % stock |
| Isopropyl alcohol prep | Tyco Healthcare | 6918 | N/A |
| 30-guage needle | Terumo Medical Corp. | SG2-3013 | N/A |
| Exmire microsyringe | Ito Corporation | MS*E05 | N/A |
| Tweezertrode (tweezer electrode) | BTX Instrument, Genetronics Inc. | 522 | N/A |
| Electro Square Porator (electroporator) | BTX Instrument, Genetronics Inc. | ECM 830 | N/A |
| O.C.T. Compound | Sakura Finetek USA | 4583 | N/A |
Riferimenti
- Neumann, E., Rosenheck, K. Permeability changes induced by electric impulses in vesicular membranes. J. Membr. Biol. 10, 279-290 (1972).
- Turnbull, R. J. Letter: Letter: An alternate explanation for the permeability changes induced by electrical impulses in vesicular membranes. J. Membr. Biol. 14, 193-196 (1973).
- Zimmermann, U., Schulz, J., Pilwat, G. Transcellular ion flow in Escherichia coli B and electrical sizing of bacterias. Biophys. J. 13, 1005-1013 (1973).
- Kinosita, K., Tsong, T. Y. Voltage-induced pore formation and hemolysis of human erythrocytes. Biochim. Biophys. Acta. 471, 227-242 (1977).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-845 (1982).
- Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Dev. Biol. 233, 13-21 (2001).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 16-22 (2004).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1027-1032 (2007).
- Onishi, A. Pias3-dependent SUMOylation directs rod photoreceptor development. Neuron. 61, 234-246 (2009).
- Onishi, A. The orphan nuclear hormone receptor ERRbeta controls rod photoreceptor survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 11579-11584 (2010).
- Kim, D. S. A Core Paired-Type and POU Homeodomain-Containing Transcription Factor Program Drives Retinal Bipolar Cell Gene Expression. J. Neurosci. 28, 7748-7764 (2008).
