In elettroporazione in vivo di Retina topo in via di sviluppo

Sommario

Un metodo per l'incorporazione di DNA plasmidico in cellule murine della retina allo scopo di effettuare sia guadagno o la perdita di studi di funzione In vivo È presentato. Questo metodo sfrutta l'aumento transitorio della permeabilità delle membrane plasmatiche delle cellule indotte con l'applicazione di un campo elettrico esterno.

Abstract

La caratterizzazione funzionale di geni espressi durante lo sviluppo della retina dei mammiferi rimane una sfida significativa. Gene targeting per generare la perdita costitutivo o condizionale di knockouts funzione rimane costi e manodopera, oltre che in termini di tempo. Aggiungendo a queste sfide, retina espresso geni possono avere ruoli fondamentali al di fuori della retina che porta alla confonde involontaria quando si utilizza un approccio ad eliminazione diretta. Inoltre, la capacità di esprimere ectopica di un gene in un guadagno di esperimento funzione può essere estremamente utile quando si cerca di identificare un ruolo nella determinazione del fato cellulare e / o di differenziazione terminale.

Vi presentiamo un metodo per l'inserimento rapido ed efficiente di plasmidi DNA nella retina topo neonatale mediante elettroporazione. L'applicazione di impulsi elettrici brevi risultati di sopra di una certa intensità di campo in un aumento transitorio della permeabilità della membrana plasmatica, agevolando il trasferimento di materiale attraverso la membrana ^1,2,3,4. Lavoro pionieristico ha dimostrato che l'elettroporazione potrebbe essere utilizzato come metodo di trasferimento genico in cellule di mammifero inducendo la formazione di pori della membrana plasmatica consentendo il passaggio di DNA altamente caricato attraverso il doppio strato lipidico ^5. Continuo sviluppo tecnico, ha portato alla vitalità di elettroporazione come metodo di trasferimento genico in vivo nei tessuti di topo multiple, tra cui la retina, il metodo per il quale è qui descritto ^{6, 7, 8, 9, 10.}

Soluzione di DNA viene iniettato nello spazio sottoretinico in modo che il DNA si trova tra l'epitelio pigmentato retinico e della retina neonatale (P0) del mouse e impulsi elettrici sono applicati utilizzando un elettrodo pinzetta. Il posizionamento laterale degli occhi nel topo permette la facile orientamento dell'elettrodo pinzetta per le necessarie polo negativo-DNA-positiva retina allineamento palo. Incorporazione vasta ed espressione di geni trasferiti possono essere identificati per giorno post-natale 2 (P2). A causa della mancanza di significative migrazione laterale delle cellule della retina, le regioni elettroporate e non elettroporate vengono generati. Non elettroporate regioni possono servire come controlli interni istologici, se del caso.

Elettroporazione della retina possono essere usate per esprimere un gene con un promotore ubiquitario, come CAG, o di distruggere la funzione del gene utilizzando costrutti shRNA o Cre-ricombinasi. Espressione più mirata può essere raggiunto attraverso la progettazione costruisce con i promotori dei geni cellulari specifici. Visualizzazione di cellule elettroporate si ottiene utilizzando i costrutti bicistronic esprimono GFP o da co-electroporating un'espressione GFP costrutto. Inoltre, costruisce multiple possono essere elettroporate per lo studio degli effetti gene combinatoria o aumento simultaneo e la perdita di funzione di geni diversi. Elettroporazione retina può anche essere utilizzato per l'analisi di genomica cis-normativo elementi generando costruisce espressione appropriata e mutanti di delezione. Tali esperimenti possono essere usati per identificare le regioni sufficienti o necessari per l'espressione genica delle cellule specifiche ¹¹ cis-normativo. Esperimenti potenziali sono limitati solo dalla disponibilità di costruire.

Protocollo

1. Preparazione plasmide per l'elettroporazione

La concentrazione del DNA necessario per elettroporazione è 5μg/μl. Ciò richiede in genere i plasmidi desiderato di essere amplificato utilizzando un maxi-prep (Qiagen) o metodo equivalente seguita da una purificazione e concentrazione del DNA per la quantità di lavoro. Di seguito viene descritto la preparazione del DNA per la quantità di lavoro.

1. Aliquota 100 mg di DNA (da maxi-prep o equivalente) e diluire il volume di 100 l per la facilità di manipolazione.
2. Aggiungi fenolo, la quantità di fenolo deve essere calcolata per ottenere un circa 60% di DNA / volume (mg DNA: v....

Discussione

Elettroporazione in vivo rappresenta un metodo rapido ed efficiente per la trasformazione delle cellule della retina con plasmidi di espressione del DNA. Questo metodo permette di effettuare lo sperimentatore guadagno di studi funzione ectopica l'introduzione di un gene di interesse sotto il controllo di un promotore ubiquitariamente espressa o per effettuare la perdita di studi di funzione utilizzando i costrutti shRNA targeting dei geni di interesse. Inoltre, i plasmidi di DNA multipli possono essere elet.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Buffer saturi fenolo	Invitrogen	15513-039	N / A
Cloroformio	JT Baker	9180-03	N / A
Di sodio acetato	JT Baker	3470-05	3 M magazzino
Verde fast FCF	Fisher Biotech	BP123-10	10% di magazzino
Alcool isopropilico prep	Tyco Healthcare	6918	N / A
30-ago spessore e trattati	Terumo Medical Corp.	SG2-3013	N / A
Exmire microsiringa	Ito Corporation	MS * E05	N / A
Tweezertrode (elettrodo pinzetta)	BTX strumento, Genetronics Inc.	522	N / A
Electro Piazza Porator (elettroporatore)	BTX strumento, Genetronics Inc.	ECM 830	N / A
Ottobre Compound	Sakura Finetek USA	4583	N / A