Questo articolo presenta un metodo basato citometria di flusso per studiare la composizione immunitario dei aorte. Il documento illustra anche una tecnica aggiuntiva che consente di esaminare avventizia circostante e parete del vaso a parte. Questo metodo apre la possibilità di eseguire analisi fenotipica dei leucociti aortica e applicare diversi saggi immunologici per gli studi di aterosclerosi.
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Articolo metodologico
Analisi Citometria a flusso di cellule immunitarie all'interno aorte Murine
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'aterosclerosi è un processo infiammatorio cronico delle imbarcazioni medie e grandi dimensioni che è caratterizzata dalla formazione di placche composto da cellule schiumose, cellule del sistema immunitario, cellule muscolari lisce ed endoteliali, piastrine, matrice extracellulare, e un nucleo ricco di lipidi con necrosi estesa e fibrosi dei tessuti circostanti. 1 Il braccio innata e adattiva della risposta immunitaria sono coinvolti nello sviluppo di iniziazione, e la persistenza di aterosclerosi. 2, 3 Vi è un corpus significativo di prove che diversi sottoinsiemi di cellule immunitarie, come i macrofagi, dendritiche cellule, linfociti T e B, sono presenti all'interno della aorte di topi sani e aterosclerosi a rischio 4. Inoltre, le cellule immunitarie si trovano nel avventizia aortica circostante che suggerisce un ruolo importante di questo tessuto nell'aterogenesi 2.
Da qualche tempo, la rilevazione quantitativa di diversi tipi di cellule immunitarie, il loro stato di attivazione, e la composizione cellulare all'interno della parete aortica è stato limitato mediante RT-PCR e metodi immunoistochimici per lo studio dell'aterosclerosi. Pochi tentativi sono stati fatti per eseguire citometria a flusso utilizzando aorte umane, e una serie di problemi, come un autofluorescenza alto, sono stati riportati 5,6. Placche aterosclerotiche umane sono stati digeriti con collagenasi 1, e celle libere sono stati raccolti e colorate per CD14 + / CD11c + per evidenziare macrofagi derivati da cellule schiumose. In questo studio, un canale "finto" è stato usato per evitare falsi positivi colorazione. 6 materiali necrotiche accumulano durante il processo di digestione dar luogo a una grande quantità di detriti che genera una autofluorescenza alta nei campioni aortica. Per risolvere questo problema, un gruppo di controlli negativi e positivi è stato proposto, ma solo doppia colorazione potrebbe essere applicata in questi campioni. Abbiamo sviluppato un nuovo flusso di citometria metodo basato su 7 per analizzare la composizione delle cellule immunitarie e caratterizzare l'attivazione, la proliferazione, la differenziazione delle cellule del sistema immunitario in buona salute e aterosclerosi dell'aorta a rischio. Questo metodo permette l'indagine della composizione cellule immunitarie della parete aortica e apre possibilità di utilizzare un ampio spettro di metodi immunologici per le indagini degli aspetti immunitario di questa malattia.
Protocollo
1. Isolamento di aorte murino
Approvazione del comitato istituzionale IACUC della procedura è richiesto di lavorare con i topi.
- Preparare heparinzed PBS con l'aggiunta di 1000 unità di eparina sodica a 50 ml di PBS e invertendo il tubo per mescolare. Preparare una provetta vuota per la raccolta del sangue e un tubo di raccolta contenente PBS per ogni aorta da raccogliere. Mantenere tutte le provette su ghiaccio.
- Eparinizzare una siringa di sangue disegno (0,1 ml di 1000 U / ml di sodio eparina), preparare gli strumenti chirurgici (due paia di pinzette ricurve, un paio di forbici da dissezione, e un paio di microshears....
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Discussione
Qui, vi presentiamo un metodo di citometria a flusso basato per lo studio della composizione delle cellule immunitarie di aorte murini. Il principale vantaggio di questo metodo è la capacità di analizzare aortica cellule del sistema immunitario ad un livello singola cellula e di caratterizzare lo stato di attivazione dei leucociti aortica. Questo metodo non si limita a aorte murina e noi (dati non pubblicati) e altri 10 utilizzati questo approccio per analizzare campioni umani come arteria mammaria interna, v.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health di sovvenzione: PO1 HL55798 (a KL) e dell'American Heart Association Scientist Development Grant 0525532U (a EG).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Materiale | Numero di catalogo | Azienda | |
| Collagenasi XI | C7657 | Sigma-Aldrich | |
| Ialuronidasi | H3506 | Sigma-Aldrich | |
| DNasi I, di tipo 2 | D4527 | Sigma-Aldrich | |
| Collagenasi I | C0130 | Sigma-Aldrich | |
| Collagenasi II | LS004174 | Worthington Corporation biochimici | |
| Elastasi | LS002292 | Worthington Corporation biochimici |
Riferimenti
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-2341 (2000).
- Galkina, E., Ley, K. Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis. Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).
- Hansson, G. K., Libby, P.
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Ristampe e permessi
