Environmental Bakterioplankton sind mit einem Modell des gelösten organischen Kohlenstoffs (DOC)-Verbindung und einer DNA Markierungsreagens, Bromdesoxyuridin (BrdU) inkubiert. Anschließend werden DOC-abbauenden Zellen aus dem Bulk-Community auf ihre erhöhte BrdU-Einbaus mittels Fluoreszenz-activated cell sorting (FACS) basiert getrennt. Diese Zellen werden dann durch nachfolgende molekulare Analysen identifiziert.
Mikroben sind wichtige Mittel der Vermittlung der Abbau von zahlreichen gelösten organischen Kohlenstoffs (DOC) Substrate in der aquatischen Umwelt. Allerdings stellt Identifizierung von Bakterien-Taxa, dass bestimmte Pools von DOC in der Natur verwandeln eine technische Herausforderung.
Hier beschreiben wir einen Ansatz, Paare Bromdesoxyuridin (BrdU) Inkorporation, Fluoreszenz-activated cell sorting (FACS) und 16S rRNA-Gen-basierte molekulare Analyse, dass die Kultur-unabhängige Identifizierung Bakterioplankton, die einen Abbau einer bestimmten DOC Verbindung in der aquatischen Umwelt ermöglicht. Triplicate Bakterioplankton Mikrokosmen sind bis zu beiden BrdU und ein Modell DOC Verbindung (DOC Änderungen), oder nur BrdU (no-Neben-Steuerung) zu empfangen. BrdU ersetzt die Positionen von Thymidin in neu synthetisierte Bakterien-DNA und BrdU-markierte DNA kann leicht immunodetected 1,2 sein. Durch eine 24-Stunden-Inkubation Bakterioplankton, dass in der Lage, die hinzugefügt DOC Verbindung erwartet werden, um selektiv aktiviert werden, und haben daher ein höheres BrdU-Einbau (HALLO-Zellen) als non-responsive Zellen in der DOC Änderungen und Zellen in nicht-sind Zusätzlich steuert (low BrdU-Einbau-Zellen, LI-Zellen). Nach Fluoreszenz Immundetektion sind HALLO Zellen unterschieden und körperlich von der LI-Zellen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) 3 getrennt. Sortiert DOC-responsive Zellen (HALLO-Zellen) sind für die DNA extrahiert und taxonomisch durch nachträgliche 16S rRNA-Gen-Analysen, einschließlich PCR, Klon-Bibliothek Bau-und Sequenzierung identifiziert.
Unser Ansatz Paare BrdU-Einbau, FACS und 16S rDNA-Analyse zu ermöglichen Arten-Identifikation auf der Bakterioplankton, dass die einzelnen Komponenten DOC verstoffwechseln in der aquatischen Umwelt. Die BrdU-Einbau-Assay Etiketten Bakterienzellen auf Stoffwechselaktivitäten, die Analyse erlaubt nur auf aktive Bakterien und somit nicht enthalten ruhenden Zellen. In unserem Ansatz wird BrdU-Einbau in situ immunodetected und Bakterien, die verschiedenen Ebenen des BrdU-Einbaus haben, sind anschließend visualisi…
The authors have nothing to disclose.
Die Finanzierung dieses Projekts wurde von der National Science Foundation gewährt OCE1029607 (XM) und MCB0702125 (MAM) und Gordon und Betty Moore Foundation (MAM) zur Verfügung gestellt.
Name | Tipo | Company | Catalog number | Comments |
BrdU | Reagent | Sigma | B5002-5G | |
Lysozyme | Reagent | Sigma | L6876-5G | |
Proteinase K | Reagent | Sigma | P2308-25MG | |
In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS | Kit | Roche | 11810740001 | Consume more of Anti-BrdU-FLUOS and Incubation buffer per reaction than suggested by the manufacturer. |
Frame-Seal Incubation Chambers | Material | Bio-Rad | SLF-1201 | |
Polycarbonate Membrane Filters (142-mm-diameter, 1.0 μm-pore-size) | Material | Millipore | FALP14250 | |
Polycarbonate Membrane Filters (25-mm-diameter, 0.2 μm-pore-size) | Material | Millipore | FGLP02500 | |
illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads | Kit | GE Healthcare | 27-9559-01 | |
QIAquick gel extraction kit | Kit | QIAGEN | 28704 | |
FailSafe PCR System | Kit | EPICENTRE | FS99060 |