ブロモデオキシウリジン（BrdU）標識と溶存有機の文化に依存しない識別に対する後続の蛍光活性化細胞選別カーボン分解Bacterioplankton
Summary
環境bacterioplanktonは、有機炭素（DOC）化合物とDNA標識試薬、ブロモデオキシウリジン（BrdU）を溶解モデルとインキュベートされています。その後、DOC分解細胞は、蛍光活性化細胞選別（FACS）を使用して自身の昇格BrdUの取り込みに基づいてバルクコミュニティから分離されています。これらの細胞は、その後の分子生物学的解析によって識別されます。
Abstract
微生物は、水生環境における多数の溶存有機炭素（DOC）基質の分解を仲介する主要なエージェントです。しかし、自然の中でDOCの特定のプールに変換細菌の分類群の同定には、技術的な課題となっています。
ここでは、アプローチを説明しているカップルのブロモデオキシウリジン（BrdU）の取り込み、蛍光活性化細胞選別（FACS）、および16S水生環境において分解する特定のDOCの化合物の能力bacterioplanktonのカルチャに依存しない識別を可能にするrRNA遺伝子に基づく分子解析。三連のbacterioplanktonの小宇宙を、BrdUとモデルのDOCの化合物（DOC修正）、または唯一のBrdU（無添加制御）の両方を受け取るよう設定されております。 BrdUの代替は、新たに合成された細菌DNAおよびBrdU標識DNAのチミジンの位置は容易に免疫検出1,2できます。 24時間のインキュベーションを通じて、付加価値DOCの化合物を使用することができるbacterioplanktonが選択的に活性化し、それゆえにDOCの改正と細胞に非応答性細胞よりBrdU取り込み（HI細胞）のレベルが高いことが期待されているは、さらにコントロール（低BrdU取り込み細胞、LI細胞）。蛍光免疫検出した後、HIの細胞が区別され、物理的に蛍光活性化細胞選別（FACS）3でLI細胞から分離。ソートされたDOC -応答性細胞は（HI細胞）のDNAを抽出し、分類学的PCR、クローンのライブラリー構築と塩基配列決定を含め、その後の16S rRNA遺伝子ベースの解析によって識別されます。
Protocol
Discussion
水生環境での個々のDOC成分を代謝するbacterioplanktonの種レベルの識別を可能にするために我々のアプローチのカップルBrdUの取り込み、FACSおよび16S rDNAの解析。のみ活性細菌の解析を可能にするため、休眠細胞が含まれていない代謝活動に基づいて、BrdU取り込みアッセイラベル細菌細胞、。我々のアプローチでは、BrdUの取り込みは、その後に可視化するBrdUの取り込みのレベルが異なる免?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトの資金は、国立科学財団助成金OCE1029607（XMまで）とMCB0702125（MAMへ）とゴードンとベティムーア財団（MAMへ）によって提供されていました。
Materials
| Name | Tipo | Company | Catalog number | Comments |
| BrdU | Reagent | Sigma | B5002-5G | |
| Lysozyme | Reagent | Sigma | L6876-5G | |
| Proteinase K | Reagent | Sigma | P2308-25MG | |
| In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS | Kit | Roche | 11810740001 | Consume more of Anti-BrdU-FLUOS and Incubation buffer per reaction than suggested by the manufacturer. |
| Frame-Seal Incubation Chambers | Material | Bio-Rad | SLF-1201 | |
| Polycarbonate Membrane Filters (142-mm-diameter, 1.0 μm-pore-size) | Material | Millipore | FALP14250 | |
| Polycarbonate Membrane Filters (25-mm-diameter, 0.2 μm-pore-size) | Material | Millipore | FGLP02500 | |
| illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads | Kit | GE Healthcare | 27-9559-01 | |
| QIAquick gel extraction kit | Kit | QIAGEN | 28704 | |
| FailSafe PCR System | Kit | EPICENTRE | FS99060 |
Riferimenti
- Pernthaler, A., Pernthaler, J., Schattenhofer, M., Amann, R. Identification of DNA-synthesizing bacterial cells in coastal North Sea plankton. Appl. Environ. Microbiol. 68, 5728-5728 (2002).
- Urbach, E., Vergin, K. L., Giovannoni, S. J. Immunochemical detection and isolation of DNA from metabolically active bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 65, 1207-12 (1999).
- Mou, X. Z., Hodson, R. E., Moran, M. A. Bacterioplankton assemblages transforming dissolved organic compounds in coastal seawater. Environ. Microbiol. 9, 2025-2025 (2007).
- Hodson, R. E., Dustman, W. A., Garg, R. P., Moran, M. A. In situ PCR for visualization of microscale distribution of specific genes and gene products in prokaryotic communities. Appl. Environ. Microbiol. 61, 4074-4074 (1995).
- Dinjens, W. N. Bromodeoxyuridine (BrdU) immunocytochemistry by exonuclease III (Exo III) digestion. Histochemistry. 98, 199-199 (1992).
- Kirchman, D. L., Yu, L. Y., Fuchs, B. M., Amann, R. Structure of bacterial communities in aquatic systems as revealed by filter PCR. Aquat. Microb. Ecol. 26, 13-13 (2001).
- Delong, E. F., Wickham, G. S., Pace, N. R. Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells. Science. 243, 1360-1360 (1989).
- Artursson, V., Jansson, J. K. Use of bromodeoxyuridine immunocapture to identify active bacteria associated with arbuscular mycorrhizal hyphae. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6208-6208 (2003).
- Mou, X. Z. Bacterial carbon processing by generalist species in the coastal ocean. Nature. 451, 708-708 (2008).
- Mou, X. Flow-cytometric cell sorting and subsequent molecular analyses for culture-independent identification of bacterioplankton involved in dimethylsulfoniopropionate transformations. Appl. Environ. Microbiol. 71, 1405-1405 (2005).
- Dean, F. B. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5261-5261 (2002).
