Bromodeoxyuridine (BrdU) märkning och Efterföljande Fluorescens Aktiverat cellsortering för kultur-oberoende identifiering av löst organiskt kol-nedbrytande bakterioplankton
Summary
Miljö bakterioplankton inkuberas med en modell som löst organiskt kol (DOC) förening och ett DNA-märkning reagens, bromodeoxyuridine (BrdU). Efteråt är DOC-nedbrytande celler skilda från huvuddelen gemenskapen som baseras på förhöjda BrdU införlivande med fluorescens aktiverad cell sortering (FACS). Dessa celler är sedan identifieras med efterföljande molekylära analyser.
Abstract
Mikroberna är stora aktörer förmedla nedbrytning av många löst organiskt kol (DOC) substrat i akvatiska miljöer. Dock innebär identifiering av bakterier taxa som omvandlar vissa pooler av DOC i naturen en teknisk utmaning.
Här beskriver vi ett arbetssätt som par bromodeoxyuridine (BrdU) bolagsordning, fluorescens aktiverad cell sortering (FACS) och 16S rRNA gen-baserad molekylär analys som gör att kultur-oberoende identifiering av bakterioplankton kan förnedrande en specifik DOC förening i vattenmiljöer. Tre exemplar bakterioplankton mikrokosmos är konfigurerade för att ta emot både BrdU och en modell DOC förening (DOC ändringar), eller bara BrdU (no-tillägg kontroll). BrdU substitut positioner tymidin i nya syntetiseras bakterie-DNA och BrdU-märkt DNA kan lätt immunodetected 1,2. Genom en 24-timmars inkubation bakterioplankton som kan använda de extra DOC föreningen förväntas vara selektivt aktiveras, och därför har högre nivåer av BrdU bolagsordning (HI celler) än icke-känslig celler i DOC ändringar och celler i no- Förutom kontroller (låg BrdU införlivande celler, LI celler). Efter fluorescens immunodetection är HI celler urskiljas och fysiskt separerade från LI cellerna genom fluorescens aktiverad cell sortering (FACS) 3. Sorterade DOC-känslig celler (HI celler) utvinns för DNA och taxonomiskt identifieras genom efterföljande 16S rRNA gen-analyser inklusive PCR, klon bibliotek konstruktion och sekvensering.
Protocol
Discussion
Vår strategi par BrdU bolagsordning, FACS och 16S rDNA analys att tillåta arter nivå identifiering av bakterioplankton att metabolisera individuella DOC komponenter i vattenmiljöer. Den BrdU inbyggnad analys etiketter bakterieceller baserat på ämnesomsättning, vilket gör att analysen endast på aktiva bakterier och därför inte ingår vilande celler. I vårt tillvägagångssätt är BrdU ingå i situ immunodetected och bakterier som har olika nivåer av BrdU inbyggnad därefter visualiseras, grupperas …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansieringen av detta projekt från National Science Foundation OCE1029607 (till XM) och MCB0702125 (till MAM) och Gordon och Betty Moore Foundation (till MAM).
Materials
| Name | Tipo | Company | Catalog number | Comments |
| BrdU | Reagent | Sigma | B5002-5G | |
| Lysozyme | Reagent | Sigma | L6876-5G | |
| Proteinase K | Reagent | Sigma | P2308-25MG | |
| In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS | Kit | Roche | 11810740001 | Consume more of Anti-BrdU-FLUOS and Incubation buffer per reaction than suggested by the manufacturer. |
| Frame-Seal Incubation Chambers | Material | Bio-Rad | SLF-1201 | |
| Polycarbonate Membrane Filters (142-mm-diameter, 1.0 μm-pore-size) | Material | Millipore | FALP14250 | |
| Polycarbonate Membrane Filters (25-mm-diameter, 0.2 μm-pore-size) | Material | Millipore | FGLP02500 | |
| illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads | Kit | GE Healthcare | 27-9559-01 | |
| QIAquick gel extraction kit | Kit | QIAGEN | 28704 | |
| FailSafe PCR System | Kit | EPICENTRE | FS99060 |
Riferimenti
- Pernthaler, A., Pernthaler, J., Schattenhofer, M., Amann, R. Identification of DNA-synthesizing bacterial cells in coastal North Sea plankton. Appl. Environ. Microbiol. 68, 5728-5728 (2002).
- Urbach, E., Vergin, K. L., Giovannoni, S. J. Immunochemical detection and isolation of DNA from metabolically active bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 65, 1207-12 (1999).
- Mou, X. Z., Hodson, R. E., Moran, M. A. Bacterioplankton assemblages transforming dissolved organic compounds in coastal seawater. Environ. Microbiol. 9, 2025-2025 (2007).
- Hodson, R. E., Dustman, W. A., Garg, R. P., Moran, M. A. In situ PCR for visualization of microscale distribution of specific genes and gene products in prokaryotic communities. Appl. Environ. Microbiol. 61, 4074-4074 (1995).
- Dinjens, W. N. Bromodeoxyuridine (BrdU) immunocytochemistry by exonuclease III (Exo III) digestion. Histochemistry. 98, 199-199 (1992).
- Kirchman, D. L., Yu, L. Y., Fuchs, B. M., Amann, R. Structure of bacterial communities in aquatic systems as revealed by filter PCR. Aquat. Microb. Ecol. 26, 13-13 (2001).
- Delong, E. F., Wickham, G. S., Pace, N. R. Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells. Science. 243, 1360-1360 (1989).
- Artursson, V., Jansson, J. K. Use of bromodeoxyuridine immunocapture to identify active bacteria associated with arbuscular mycorrhizal hyphae. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6208-6208 (2003).
- Mou, X. Z. Bacterial carbon processing by generalist species in the coastal ocean. Nature. 451, 708-708 (2008).
- Mou, X. Flow-cytometric cell sorting and subsequent molecular analyses for culture-independent identification of bacterioplankton involved in dimethylsulfoniopropionate transformations. Appl. Environ. Microbiol. 71, 1405-1405 (2005).
- Dean, F. B. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5261-5261 (2002).
