ReAsH / فلاش الوسم وتحليل صورة البروتينات في خلايا الاستشعار Tetracysteine
Summary
والأصباغ biarsenical الفلاش وReAsH خصيصا لربط الزخارف tetracysteine في البروتينات ، ويمكن تسمية انتقائي البروتينات في الخلايا الحية. مؤخرا تم استخدام هذه الاستراتيجية لتطوير أجهزة الاستشعار التوسيم لبروتين مختلفة التشكل أو الدول oligomeric. وصفنا نهج وضع العلامات وطرق لتحليل كمي ملزمة.
Abstract
البروتينات الفلورية والأصباغ وأدوات أساسية لدراسة توطين البروتين والاتجار بها وظيفة في الخلايا. في حين تم البروتينات الفلورية مثل البروتين مضان أخضر (GFP) المستخدمة على نطاق واسع باعتبارهم شركاء الانصهار للبروتينات لتتبع خصائص بروتين المصالح 1 ، والتطورات الأخيرة مع أصغر به تمكين وظائف جديدة من البروتينات التي يتعين بحثها في الخلايا مثل تغيير متعلق بتكوين والبروتين وتكوين الجمعيات 2 ، 3. نظام واحد ينطوي على سمة صغيرة عزر tetracysteine (CCXXCC) إدراج وراثيا في البروتين المستهدف ، والذي يربط biarsenical الأصباغ ، ReAsH (أحمر فلوري) وفلاش (الفلورية الخضراء) ، مع خصوصية عالية حتى في الخلايا الحية 2. نظام صبغ TC / biarsenical عروض قيود أقل بكثير الفراغية للبروتين المضيف من البروتينات الفلورية التي مكنت عدة مقاربات جديدة لقياس التغيير متعلق بتكوين والبروتين البروتين التفاعلات 4-7. نحن وضعت مؤخرا تطبيق الرواية من العلامات TC وأجهزة الاستشعار من oligomerization في الخلايا معربا عن huntingtin متحولة ، والتي عندما تحولت المجاميع في الخلايا العصبية في مرض هنتنغتون 7. وكان الموسومة Huntingtin مع اثنين من الأصباغ الفلورية ، واحدة بروتين فلوري لتتبع مكان البروتين ، والثاني علامة TC الوحيد الذي يربط الأصباغ biarsenical في مونومرات. وبالتالي ، تمكين تغييرات في colocalization بين البروتين والتفاعل صبغ biarsenical قليل وحدات غير مرئي بالمجهر المحتوى ليتم تعيينها مكانيا داخل الخلايا. هنا ، نحن تصف كيفية تسمية TC – الموسومة بروتينات تنصهر لبروتين فلوري (الكرز ، أو GFP CFP) مع فلاش أو ReAsH في خلايا الثدييات الحية وكيفية قياس مضان اللون اثنين (الكرز / فلاش ، CFP / فلاش أو GFP / تركيبات ReAsH).
Protocol
Discussion
نهج التعريب البروتين التسمية مع بروتين فلوري وخصائص متعلق بتكوين مع صبغة second تقدم إمكانات كبيرة لرسم الخرائط حيث التشكل مختلفة من بروتينات تتراكم في الخلايا والأحداث التي تغير ديناميات التشكل البروتين. وقد استخدم لأول مرة ReAsH / فلاش وجهاز استشعار في الخلية للطي البر…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق منح لDMH وTDM (NHMRC منح المشاريع). DMH زميل Grimwade ، بتمويل من صندوق Miegunyah.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| 8-well μ-slides | Ibidi | 80826 | We find these chamber slides to be particularly useful for culturing cells for imaging. |
| TC-FlAsH II In-cell Tetracysteine Tag Detection Kit *green fluorescence* *for live-cell imaging | Invitrogen | T34561 (FlAsH) or T34562 (ReAsH) | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-103 | |
| 2,3-Dimercapto-1-propanol | Sigma-Aldrich | D1129-5ML | |
| 1,2-Ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 02390-25ML |
Riferimenti
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-2672 (1998).
- Uttamapinant, C. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).
- Ignatova, Z., Gierasch, L. M. Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).
- Coleman, B. M. Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).
- Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH. Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).
- Ramdzan, Y. M. Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells. Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).
- Abramoff, M. a. g. e. l. h. a. e. s., PJ, S. J. R. a. m. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Hearps, A. The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells. J. Fluor. 17, 593-597 (2007).
- Adams, S. R. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).
