Il biarsenical coloranti Flash e ReAsH legano specificamente ai motivi tetracysteine di proteine e in modo selettivo le proteine etichetta in cellule vive. Recentemente questa strategia di etichettatura è stato utilizzato per sviluppare sensori per le diverse conformazioni delle proteine o stati oligomerici. Abbiamo descritto l'approccio di etichettatura e di metodi per analizzare quantitativamente vincolanti.
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Articolo metodologico
ReAsH / Flash Etichettatura e Image Analysis di proteine sensore Tetracysteine nelle celle
In questo articolo
Sommario
Abstract
Proteine fluorescenti e coloranti sono strumenti essenziali per lo studio del traffico di proteine, la localizzazione e la funzione delle cellule. Mentre le proteine fluorescenti come il verde proteina fluorescente (GFP) sono stati ampiamente utilizzati come partner di fusione di proteine per monitorare le proprietà di una proteina di interesse 1, i recenti sviluppi con piccole etichette consentono nuove funzionalità di proteine da esaminare nelle cellule, come il cambiamento conformazionale e proteine-associazione 2, 3. Un sistema di tag piccola comporta un motivo tetracysteine (ccxxcc) geneticamente inserito in una proteina bersaglio, che si lega ai coloranti biarsenical, ReAsH (rosso fluorescente) e Flash (verde fluorescente), con elevata specificità anche nelle cellule vive 2. Il TC / biarsenical sistema colorante offre vincoli molto meno sterico alla proteina ospite di proteine fluorescenti che ha permesso a numerosi nuovi approcci per misurare il cambiamento conformazionale e interazioni proteina-proteina 4-7. Abbiamo recentemente sviluppato una nuova applicazione di tag TC come sensori di oligomerizzazione nelle cellule che esprimono huntingtina mutata, che se mutato aggregati nei neuroni a Huntington malattia 7. Huntingtina era taggati con due coloranti fluorescenti, una una proteina fluorescente per tenere traccia posizione di proteine, e la seconda un tag TC che lega solo coloranti biarsenical in monomeri. Quindi, i cambiamenti colocalizzazione tra proteine e biarsenical reattività colorante abilitato contenuto submicroscopiche oligomero di essere mappate spazialmente all'interno delle cellule. Qui, descriviamo come etichettare TC-tagged proteine fuse ad una proteina fluorescente (Cherry, GFP o CFP) con il flash o ReAsH in vivo le cellule di mammifero e come quantificare i due fluorescenza di colore (ciliegio / Flash, CFP / Flash o GFP / combinazioni ReAsH).
Protocollo
1. Preparazione delle cellule per l'etichettatura con ReAsH / Flash
- Usando metodi standard di coltura cellulare per la linea cellulare di interesse, preparare una coltura di cellule aderenti direttamente in una diapositiva dal vivo imaging cellulare pronto per la trasfezione.
- Trasfezione vostro plasmide contenente TC-tagged gene di interesse in base al metodo di trasfezione di scelta.
Nota è importante utilizzare i controlli positivi e negativi per valutare l'entità del legame specifico ai tag TC e per valutare bleedthrough di fluorescenza tra i canali al momento del ritiro microscopio confocale. Quindi, per due....
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Discussione
L'approccio alla localizzazione etichetta proteina con una proteina fluorescente e le proprietà conformazionali con un colorante secondo offre un grande potenziale per la mappatura in cui diverse conformazioni delle proteine nelle cellule maturano e gli eventi che cambiano le dinamiche della conformazione delle proteine. ReAsH / Flash per la prima volta utilizzato come in-cell sensore per folding delle proteine dei mammiferi cellulari retinoico-binding protein I 4. In questo esempio, il Flash associat.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato da borse di DMH e TDM (NHMRC sovvenzioni per progetti). DMH è membro Grimwade, finanziato dal Trust Miegunyah.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| 8-ben μ-slide | Ibidi | 80826 | Troviamo queste camera di diapositive di essere particolarmente utile per le celle di coltura per l'imaging. |
| TC-Flash II nella cella di rilevamento Tag Tetracysteine Kit fluorescenza verde * * * per il live-cell imaging | Invitrogen | T34561 (Flash) o T34562 (ReAsH) | |
| Sale Hanks 'soluzione equilibrata | Invitrogen | 14175-103 | |
| 2,3-Dimercapto-1-propanolo | Sigma-Aldrich | D1129-5ML | |
| 1,2-Ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 02390-25ML |
Riferimenti
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-2672 (1998).
- Uttamapinant, C.
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Ristampe e permessi
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