Estrazione di DNA ad alta peso molecolare da Mats microbica

Summary

Forniamo un protocollo migliore per l'estrazione del DNA alto peso molecolare da stuoie microbica hypersaline. Cellule microbiche sono separate dalla matrice tappetino prima dell'estrazione del DNA e la purificazione. Questo aumenta la concentrazione, la qualità e le dimensioni del DNA. Il protocollo può essere utilizzato per altri campioni refrattari.

Abstract

Analisi di successo e preciso e l'interpretazione dei dati metagenomica dipende l'estrazione efficiente di alta qualità, ad elevato peso molecolare (HMW) del DNA della comunità. Tuttavia, i campioni di mat ambientali costituiscono spesso difficoltà ad ottenere grandi concentrazioni di alta qualità, il DNA HMW. Stuoie microbica hypersaline contengono elevate quantità di sostanze polimeriche extracellulari (EPS) 1 e sali che possono inibire le applicazioni a valle di DNA estratto. Metodi diretti e duri sono spesso utilizzati per l'estrazione del DNA da campioni di refrattari. Questi metodi sono generalmente utilizzati perché l'EPS in stuoie, una matrice adesiva, lega il DNA ^2,3 durante la lisi diretta. Come risultato di metodi di estrazione più severe, il DNA viene frammentato in piccole dimensioni ^4,5,6.

Il DNA diventa così inadeguato per la grande inserto clonazione vettore. Per aggirare queste limitazioni, si riporta un metodo migliore per estrarre il DNA HMW di buona qualità e la quantità di stuoie microbica hypersaline. Abbiamo impiegato un metodo indiretto che coinvolge la separazione di cellule microbiche dalla matrice sfondo opaco attraverso la miscelazione e la centrifugazione differenziale. Una combinazione di procedure meccaniche e chimiche è stato utilizzato per estrarre e purificare il DNA da cellule microbiche estratti. Il nostro protocollo produce circa 2 mg di HMW DNA (35-50 kb) per grammo di campione tappeto, con un _260/280 Un rapporto di 1,6. Inoltre, l'amplificazione dei geni rRNA 16S ^{7 si evince} che il protocollo è in grado di minimizzare o eliminare gli effetti inibitori dei contaminanti. I nostri risultati forniscono una metodologia adeguata per l'estrazione del DNA da HMW stuoie microbica per gli studi funzionali metagenomica e può essere applicabile ad altri campioni ambientali dai quali l'estrazione del DNA è una sfida.

Protocol

1. Cella di estrazione microbica:

1. Omogeneizzare stuoie microbica con un pestello sterile macinazione mescolando accuratamente. Mettere circa 30 g tutti (peso a umido) di materiale opaco omogeneizzato in un contenitore sterile di Waring frullatore, aggiungere circa 100 ml di 1 M NaCl (o una specifica concentrazione di campione in uso), e si fondono tre volte a velocità media per 1 minuto con raffreddamento intermittente in un congelatore di -20 ° C per 1 min. Trasferire l'impasto in una bottiglia da 250 ml centrifuga e riempire il volume vuoto rimasto con 1 M di NaCl. Preparare la soluzione di NaCl in acqua autoclavata DI e filtro sterilizzarlo.
2. U....

Discussion

Dato che la rimozione totale di cellule da campioni microbiche complesse e molto diverse tappetino non è pratico, la preoccupazione principale è come le cellule estratte rappresentano la complessiva comunità microbica tappeto. In uno studio precedente, PCR-DGGE analisi dei geni rRNA 16S microbica ha mostrato che le cinque fasi di rimozione delle cellule utilizzate in questo protocollo estratti di cellule che sono rappresentativi della comunità microbica complessiva tappeto ^7. Il numero effettivo di estrazione.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
β-mercaptoetanolo	Sigma-Aldrich	M3148
Polietilene glicole 8000	Promega	V3011	20% in 1,2 M di NaCl
Acetato di potassio	Fisher Scientific		Fisher Scientific
Quant-iT Assay kit dsDNA	Invitrogen	Q33130
RNasi	Epicentre	MRNA092
Cloruro di sodio	Prodotti chimici BDH	BDH8014	Conc appropriato.
Sodio dodecil solfato	Fisher Scientific	03-500-509	10% in acqua
sodio esametafosfato	EMD chimici	SX0583-3	2% in acqua
TBE	Fisher Scientific	BP1333-1
CHEF Mapper XA sistema	Bio-Rad Laboratories	170-3670
NanoDrop 1000 spettrofotometro	Thermo Scientific	ND-1000
Vortex	Scientific Industries Inc.
Crosslinker ultravioletti	UVP
Waring Blender	Waring laboratorio	LB10S