Microiontophoresis implica movimento de íons de uma micropipeta, em resposta a uma diferença de potencial elétrico entre o interior eo exterior da micropipeta. Moléculas biologicamente ativas são, assim, entregue em proporção à corrente elétrica. Nós ilustramos microiontophoresis acetilcolina em conjunto com micromanipulação para estudar vasodilatação dependente do endotélio na microcirculação.
Microiontophoresis implica passagem de corrente por meio de uma micropipeta ponta para proporcionar um soluto em um local designado dentro de uma preparação experimental. Microiontophoresis pode simular uma transmissão sináptica através da apresentação de neurotransmissores e neuropeptídeos em neurônios reproducibly 2. Volume negligenciável (líquido) de deslocamento evita distúrbio mecânico para a preparação experimental. Adaptar essas técnicas para a microcirculação 3 permitiu mecanismos de vasodilatação e vasoconstrição a ser estudada em nível microscópico in vivo 4,5. Uma das principais vantagens do parto localizada como está permitindo respostas vasomotor a ser estudado em locais definidos dentro de uma rede microvascular sem evocar mudanças sistêmicas ou reflexa da pressão arterial e fluxo sanguíneo do tecido, revelando assim as propriedades intrínsecas de microvasos.
Uma limitação do microiontophoresis é que a concentração precisa de agente entregue no local de interesse é difícil verificar a 6. No entanto, o seu lançamento a partir da ponta micropipeta é proporcional à intensidade e duração da ejeção do atual 2,7, de modo que reprodutíveis relações estímulo-resposta pode ser facilmente determinada em determinadas condições experimentais (descritas abaixo). Fatores adicionais que afetam a entrega microiontophoretic incluem concentração de soluto e sua ionização em solução. O diâmetro interno da ponta da micropipeta deve ser ~ 1 mm ou menos para minimizar o 'vazamento' de difusão, que pode ser combatido com uma corrente de retenção. Assim, uma corrente (positiva) para fora é usada para ejetar um cátion e uma corrente negativa, utilizado para retê-lo dentro da micropipeta.
Fabricação de micropipetas é facilitada com puxadores sofisticados eletrônicos 8. Micropipetas são extraídos de tubos capilares de vidro contendo um filamento que a solução "mechas" na ponta da micropipeta quando cheio de back-end ("preenchidos"). Isto é feito através da inserção de um tubo microcapilar conectado a uma seringa contendo a solução de interesse e solução de ejetar o para dentro do lúmen da micropipeta. Micromanipuladores permitir a colocação desejada de micropipetas dentro da preparação experimental. Micromanipuladores montado em uma base móvel pode ser posicionado em torno da preparação de acordo com a topografia das redes microvasculares (desenvolvido abaixo).
O presente protocolo demonstra microiontophoresis de acetilcolina (ACh + Cl -) em uma arteríola da preparação do músculo cremaster de rato (Veja associados protocolo: JOVE ID # 2874) para produzir vasodilatação dependente do endotélio. Entrega estímulo é sincronizada com a aquisição de imagens digitalizadas usando um disparador eletrônico. O uso de BAC-CX40 GCaMP2 ratos transgênicos 9 permite a visualização das respostas de cálcio intracelular subjacente vasodilatação arteriolar em células endoteliais na microcirculação vida.
O protocolo aqui descrito demonstra métodos para preparação e execução de micropipetas para microiontophoresis. Entrega de acetilcolina é usado para ilustrar a sinalização de cálcio vasodilatação dependente do endotélio subjacente nas arteríolas do rato anestesiado. Nossos resultados mostram que a distância a que ACh aumenta célula endotelial aumenta a fluorescência de cálcio com a intensidade de ejeção atual da micropipeta microiontophoresis (Figura 3). A falta de aumento de fluorescência em condições de repouso indica fuga desprezível de ACh da micropipeta. A falta de resposta a 100 nA intensidade do estímulo (Figura 3, legenda) mostra que uma intensidade de limiar de estimulação é necessária para o cálcio das células endoteliais a aumentar. Estas técnicas podem ser facilmente adaptadas para outros agentes vasoativos e preparações de tecido.
Considerações de ordem prática: Ao trabalhar com microiontophoresis para estudar a reatividade arteriolar, várias coisas devem ser reconhecidos. Embora tenha sido difícil para determinar a concentração real de agonista entregue, estímulo-resposta curvas são reproduzíveis dentro e entre as preparações. Estes podem ser realizados mantendo a duração de pulso constante (por exemplo, 500 ms) e variando a ejeção de corrente (por exemplo, 250, 500 e 1000 nA; Figura 3). Alternativamente, de ejeção atual pode ser mantida constante (por exemplo, a 500 nA) e duração de pulso variável (por exemplo, 250, 500 e 1000 ms). Para uma referência para as ações de um agonista de concentração definida, a preparação pode ser superfused com a solução adequada 5. Porque a força motriz para a ejeção de soluto é o movimento de carga elétrica, o agente a ser entregue deve carregar uma carga líquida a ser deslocados da micropipeta. Para garantir que o agente de interesse é o portador de carga primária, é dissolvido em concentração elevada (por exemplo, 1 M de ACh) para minimizar electro-osmose. Quando isso requer manipulação do pH da solução de enchimento micropipeta, comandos do veículo são obrigados a verificar a existência de efeitos não-específicos. Controles apropriados devem ser realizados para a passagem de corrente sozinho (por exemplo, usando micropipetas preenchido com solução salina isotônica). A distância efetiva de difusão do agente de seu local de libertação deve ser esclarecida e é mais prontamente determinada empiricamente pelo desaparecimento de uma resposta fisiológica (por exemplo, vasodilatação, ou um aumento de cálcio intracelular em cima de ejeção de ACh) como a micropipeta é posicionado no definidas distâncias do site de destino. Na prática, a distância de difusão efetivo é muito influenciada pela forma como a ponta da micropipeta é posicionado no tecido, por exemplo, se a ponta pressionado para baixo no tecido e sua ponta é ocluída, do que de ejeção é prejudicada. Tecido conectivo excessiva é particularmente problemático e deve ser removido da superfície do tecido durante a preparação cirúrgica. Atenção deve ser dada à possibilidade de esgotar a ponta do agente designado. Este é minimizado usando pulsos relativamente curto (por exemplo, ≤ s 1). Com correntes sustentada (por exemplo, alguns segundos), o agonista pode ser expulso da ponta mais rapidamente do que ele pode ser substituído por difusão a partir da solução a granel o preenchimento do micropipeta.
Porque o volume insignificante é deslocado com microiontophoresis, se alguém está tentando mudar o meio local iônicos (por exemplo, para entregar um K despolarizantes estímulo +), isso não pode ser efetivamente realizado com microiontophoresis mas é facilmente alcançada com ejeção pressão de fluido em massa tendo o desejado composição. Para a estimulação local de uma arteríola, dicas micropipeta com diâmetros internos de 2-3 mM trabalhar bem com a pressão de ejeção 4-5 psi (28-35 kPa) e duração do pulso (por exemplo, 1 segundo) controlada com uma válvula solenóide 10. Se a entrega sustentada de um agente de uma micropipeta em um microvascular é necessária, de ejeção pressão é preferível usar micropipetas de diâmetro da ponta interna adequada (por exemplo, ~ 10 mm) 11,12. Uma coluna hidrostática de altura conhecida com uma válvula torneira fornece um barato, bem definidas on / off carga de pressão constante. Taxas de fluxo são determinados pelo diâmetro interno da ponta da pipeta ea pressão de condução. Como sempre, os controles do veículo são essenciais para excluir ações inespecíficas de ejeção de pressão.
The authors have nothing to disclose.
Pesquisa no laboratório dos autores é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concede R37-HL041026, R01-R01-HL086483 e HL056786 (SSS) e F32-HL097463 e T32-AR048523 (PB) do Serviço de Saúde Pública dos Estados Unidos.
Material Used | Company | Catalogue number | Comments |
Borosilicate Glass Capillary Tubes | Warner Instruments | GC120F-10 | |
Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | model P-97 | |
Acetylcholine Chloride | Sigma-Aldrich | A6625 | |
adapter for Luer hub | Martech | AC1343 | To secure microcapillary tubing |
0.2 μm Nylon Titan filter | Sun Sri | 42204-NN | Low retention volume to minimize loss |
5 ml syringe | Becton-Dickinson Co. | 309603 | |
Pipette Holder | Warner Instruments | E45W-M12VH | |
Silver Wire | Warner Instruments | AG10W | 0.25mm diameter |
3-axis micromanipulator | Siskiyou Design Instruments | DT3-100, MXB, MXC, MGB/8 | Components for manipulator as shown |
microiontophoresis current programmer | World Precision Instruments | Model 260 | |
trigger device | Custom | custom | circuit provided in Suppl. Figure 1 |
stainless steel plate | McMaster-Carr | 1/8″ X 12″ X 12″ | According to design |
Intensified Digital Camera | Stanford Photonics Inc | XR/Mega-10 | Integrated with Piper Control software |