Жесткость внеклеточного матрикса сильно влияет на поведение нескольких прилипшие клетки. Матрица жесткости изменяется пространственно всей ткани, и подвергается модификации в различных условиях болезни. Здесь мы разрабатываем методы, чтобы охарактеризовать пространственные изменения жесткости в нормальных и фиброзных тканей легких мыши с помощью атомно-силовой микроскопии микроиндентирования.
Матрица жесткости сильно влияет на рост, дифференцировку и функцию прилипшие клетки 1-3. На макроуровне жесткости ткани и органы в человеческом теле занимать несколько порядков 4. Гораздо меньше известно о том, как жесткость колеблется в пределах пространственно тканей, и то, что масштаб и пространственный масштаб жесткости изменений в болезненные процессы, которые приводят к ткани ремоделирования. Чтобы лучше понять, как изменения в матрицу жесткости способствуют клеточной физиологии в норме и патологии, измерения жесткости тканей, полученных при пространственном масштабе, имеющие отношение к резидентам клетки необходимы. Это особенно верно для легких, высоко совместимый и упругой ткани, в которой матрица ремоделирования является характерной чертой при таких заболеваниях, как астма, эмфизема легких, гипертонии и фиброз. Для характеристики локальных механических среды паренхимы легких в пространственном масштабе, имеющие отношение к резидентам клетки, мы разработали методы прямого измерения локальных упругих свойств свежего мышиной легочной ткани с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) микроиндентирования. При соответствующем выборе АСМ индентора, консольные и углубление глубиной, эти методы позволяют измерять локальный модуль сдвига ткани параллельно с фазового контраста и флуоресценции визуализации области интереса. Систематический отбор образцов ткани полос предоставляет карты ткани механическими свойствами, которые показывают местные пространственные изменения модуля сдвига. Корреляция между механическими свойствами и лежащий в основе анатомических и патологических функций показать, как жесткость изменяется в зависимости от матрицы отложения в фиброз. Эти методы могут быть распространены на другие мягкие ткани и болезненные процессы, чтобы показать, как местные ткани механические свойства меняются в пространстве и прогрессирования заболевания.
Механические характеристики легочной ткани использованием АСМ микроиндентирования предлагает беспрецедентную пространственным разрешением (рис. 4), что обеспечивает уникальный взгляд на микромасштабной изменений в ткани жесткость. В качестве примера его полезность, предыдущие макромасштабе измерений в нормальных и фиброзной полосы ткани легкого указал примерный 2-3-кратное увеличение эластичности с фиброзом 11,12. В отличие от АСМ микроиндентирования показывает, что ткани жесткости крайне локализованным, с некоторыми регионами экспонирования до ~ 30-кратное увеличение модуля сдвига выше среднего наблюдается в нормальной ткани легкого 10. Как матрица жесткости, как теперь известно критически влияние клеточной функции, эти локальные измерения оказать неоценимую параметры для повышения достоверности биофизических параметров клеточных культур изучения клетки легких.
Несколько практических вопросов, возникающих при использовании тонких полосок ткани легкого. Поверхности полосы не идеально ровная, как ткань профиля следующим архитектура основных альвеол. Система AFM автоматически регулирует кончиком позиция в Z-направлении в течение отступы, когда высота поверхности образца изменение меньше, чем 15-мкм, чтобы помочь преодолеть эту проблему. Измерения проводились при комнатной температуре, а не 37 ° C, так что отклонения в механических свойствах, вызванные этим изменения температуры не могут быть оценены, хотя они, как ожидается, будет незначительным. Влияние основных альвеолярной архитектуры стены на наблюдаемые механические свойства трудно определить, с текущей настройки световой микроскопии. Например, было бы желательно, чтобы определить, альвеолярных стенок выставку анизотропии и различных механических свойств при отступом в направлении, в соответствие с или поперечном к плоскости стены. Однако в настоящее время образцы толстые и системы визуализации не имеет возможности 3D, следовательно, это не представляется возможным определить местные альвеолярного ориентации стены в каждой точке контакта. Наконец, влияние сотовых составляющих на измеряемых механических свойств остается не полностью выяснены. В методы, описанные здесь, не предпринимаются усилия по специально удалить сотовой составляющих ткань. Тем не менее, клетки, присутствующие на площади, предназначенной для отступа, вряд ли будут жизнеспособными данного времени, прошедшего с урожая ткани и необходимость сокращения ткани, чтобы получить доступ к альвеол. Специальные эксперименты, чтобы удалить клетки, или повторного заполнения матрицы с жизнеспособных клеток, и оценить соответствующие изменения в ткани жесткость представляется оправданным.
Потому что свежие незаписанных ткани необходимы для этих измерений, время, прошедшее от ткани жатвы, чтобы измерение должно быть сведено к минимуму и образцы должны храниться при температуре 4 ° С, чтобы избежать изменения механических свойств. Особое внимание должно быть уделено всякий раз, когда ткани полосы передаются между контейнерами во время мытья или окрашивания, так что минимальные искажения или повреждения не генерируется. Для АСМ применение в жидкости, важнейшим шагом является сокращение ткани плоской, как можно и обездвижить образца на поддержку покровное. Если возможно, автоматизированных секционирования машин, таких как vibratome или ткани резки можно использовать, чтобы сократить ломтиками очень равномерной толщины. Важно приложить ткань полосы непосредственно перед АСМ измерений и минимизировать время, затраченное на АСМ измерений в качестве образца, в конечном счете оторваться от покровных. Одним из полезных наблюдений, что более крупные полосы появляются приложить более стабильно, чтобы покрыть скользит и остаются на месте для более длительные в ФСБ, чем меньше полос.
АСМ микроиндентирования можно охарактеризовать образцы охватывающих широкий диапазон от 100 Па до 50 кПа (модуль сдвига) при использовании стандартных 0,06 Н / м кантилевера с 5 мкм в диаметре сферического наконечника. Этот диапазон может быть расширен с помощью зондов с различными постоянными весной; АСМ зонды со сферическими советы стекла от 0,6 до 12 мкм в диаметре и весной константы в диапазоне от 0,01 до 0,58 Н / м имеются в продаже (например, Novascan) и обычно используется 3. С 5 мкм сферическим наконечником, теоретическая площадь контакта между зондом и тканей составляет около 5-9 мкм 2 для 400-700 нм отступа (рис. 1А). Меньше или больше, советы могут быть использованы для обеспечения большего или меньшего масштаба пространственного разрешения. Пирамидальная советы были также использованы в АСМ микроиндентирования 13-16, обеспечивая меньшие области контакта и тем самым увеличивая пространственным разрешением в картографии, хотя данные установки является более сложной для этой геометрии зонда.
Некоторые ограничения этого метода должно быть отмечено. Легких традиционно характеризуется механическим неинвазивно, например, с использованием давление-объем анализ 17 или удар-отступ целом легкие 19,20. Инвазивные методы, такие как описан здесь изменить легких архитектуры в важных путей, через потерю воздушно-жидкостной Interface, которые обычно существуют в заполненных воздухом легких и потери предварительного напряжения, который поддерживает легких частичной инфляции при релаксации дыхательных мышц. Эти ограничения являются общими для всех измерений, выполненных в легочную ткань полосы 18. Примечательно, однако, средняя жесткость измеряется в паренхиме нормальной ткани легкого (модуль сдвига ~ 0.5kPa) не отличается существенно от оценки, основанные на удар-отступы интактных легких при покоя объемы 19,20. Хотя легочной ткани, как известно, выставка нелинейной жесткости с ростом деформации, это не возможно проверить в строгой моде ли это свойство сохраняется вплоть до микро-масштабе с методов, используемых здесь. Модель Герц предполагает однородность выборки. Однако большинство биологических материалов, в том числе легочной паренхимы, все чаще гетерогенных при уменьшении пространственных масштабов. Неоднородность образца может привести к помехам, как изменение модуля Юнга в зависимости от глубины отступа, т.е. в зависимости от слоя или компонент, деформирующий. Неоднородности в плоскости х, может быть ограничено путем тщательного выбора соответствующих сферических размер наконечника в зависимости от микроструктуры биоматериала, предложенные Димитриадис Е.К. и др. 8. Это гораздо более трудно предсказать или исправить Герц модель ошибок из-за материальных неоднородность в Z-направлении. Azeloglu и соавт. недавно предложил гибридные вычислительные модели для характеристики упругих свойств гетерогенных подложки с дискретным встроенным включений 21. Их новая техника обеспечивает потенциальное средство для расчета включение свойств гетерогенных материалов преодоления ограничений Герца анализа.
Модель Герц также предполагает абсолютного упругого поведения, в то время как биологические материалы обычно отображают зависящих от времени поведения вязкоупругих. Полной характеристики вязкоупругих ткани могут быть получены путем изменения отступа скоростях используются. Важно отметить, что предыдущий макромасштабе механических испытаний нормальных и фиброзной ткани легкого демонстрирует слабую зависимость частоты легочной ткани механических свойств, и сохранение различий между нормальным и фиброзной ткани механических свойств на всех частотах испытания 11. Эти данные убедительно показывают, что измерения механических свойств с помощью одной скорости вдавливания АСМ фиксирует существенный аспект изменения в тканях механических свойств, которые сопровождают фиброза.
Коэффициент Пуассона 0,4 для легких тканей, используемых в этой работе составляет от макроскопических измерений 9. К сожалению, коэффициент Пуассона на микро-масштабе, и любые изменения в болезненного состояния не доступны в литературе. В качестве альтернативы Е, Е / (1-υ 2) или (1-υ 2) / πE (обозначается упругости к) 22 может быть рассчитана по микроиндентирования АСМ и сообщили, когда коэффициент Пуассона, неизвестно. Для большинства биоматериалов коэффициент Пуассона находится в диапазоне от 0,4 до 0,5 из-за их высокого содержания воды. В диапазоне 0,3-0,5, коэффициент 1 / (1-υ 2) меняется только от 1.10-1.33, например, что разумные изменения коэффициента Пуассона оказывают лишь незначительное влияние на отчетный модуль. Увеличение модуля сдвига, что мы отчете за фиброзных тканей относительной к нормальной ткани в несколько раз по величине, подразумевая, что ошибки, связанные с изменением коэффициента Пуассона являются незначительными по отношению к изменениям механических свойств наблюдается.
Фактический алгоритм и код, который может быть использован для анализа сила-смещение данных с учетом конкретных условий применения и последующей характеристики различных групп населения форс-смещение кривых. Если более сложный анализ представляет интерес, можно ознакомиться с работой Лина и др.. 23. Авторы составлен ряд синергетических стратегий в алгоритм, который позволяет преодолеть многие из осложнений, которые ранее препятствует усилиям по автоматизации установки Герца моделей отступа данных.
Несколько других областях доступны для дальнейшего развития и использования этого метода. В случаях, когда есть заинтересованность в визуализации альвеолярных стены без антител маркировки, как эластин и коллаген могут быть визуализированы с их autofluorescent сигнал в зеленом спектре. С другой стороны, лучше с изображениями, используя либо тоньше срезах тканей, 3D методов визуализации, или обоих, могло бы повысить умение соотносить ткани архитектуры с основными механическими свойствами. Хотя в настоящее время методы позволяют окрашивания и визуализации компонентов внеклеточного матрикса, таких как коллаген и ламинин, дополнительные усилия могли бы быть направлены на окрашивание маркеры клеточной поверхности для определения конкретных клеточных популяций и охарактеризовать механические микросреды в непосредственной близости от таких групп населения. Alternatively, ткань может быть собран из мышей, экспрессирующих флуоресцентно с метками линии маркеров или сотовый специфических белков к достижению той же цели. Наконец, метод подробно описаны здесь появляется хорошо подходит для характеристики других анатомических особенностей в легких, таких как суда, которые реконструируют при гипертонии, и дыхательные пути которых реконструируют в астму. Основываясь на своем текущем состоянии развития и потенциал для дальнейшего расширения, АСМ микроиндентирования, похоже, намерен дать ценную способность проникновения в суть изменений в тканях жесткости, которые сопровождают развитие болезни в легких, и, несомненно, будет иметь значение для характеристики пространственных и временных изменений Жесткость ряд других мягких тканей.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим А. Тагер и Б. Ши за их постоянное сотрудничество, а также для обеспечения легочной ткани используются для демонстрационных целей здесь. Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья грант HL-092 961. Эта работа была выполнена частично в Центре наноразмерных систем (ЦНС), член Национальной сетевой инфраструктуры нанотехнологий, которая поддерживается Национальным Фондом Науки под NSF награду ECS-0335765. ЦНС является частью факультета искусств и наук в Гарвардском университете.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
AFM tip | Novascan | PT.GS | 5 micron Borosilicate bead, 0.06 N/m |
Poly-L-Lysine coverslips | VWR | 354085 | BD BioCoat 12 mm round No.1 glass |
Agarose, Low Gelling Temperature | Sigma | A0701 | |
Rabbit anti-Collagen I (Rb pAb) antibody | Abcam | ab34710-100 | |
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit antibody | Invitrogen | A11010 | |
Rabbit anti-Laminin | Sigma | L9393 |