农杆菌介导的病毒诱导的基因沉默含量在棉花
Summary
我们目前为农杆菌介导的病毒诱导的基因沉默（VIGS）棉花检测的详细协议。烟草脆裂病毒（TRV）派生的VIGS载体部署GrCLA1棉花，Cloroplastos alterados 1基因诱导RNA沉默。白化沉默GrCLA1引起的表型观察接种后2个星期内，在苗期。
Abstract
棉花（ 陆地棉 ）是全球最重要的农作物之一。分子育种新品种已相当大的努力。大规模基因功能分析棉花已经落后于最现代的植物物种，可能是由于其基因组，基因复制和多倍体，生长周期长和遗传转化 1顽抗的大尺寸。为了方便的高通量功能基因/基因棉花的研究，我们尝试发展快速，高效的瞬态分析评估棉花基因的功能。
病毒诱导的基因沉默（VIGS）是一个强大的技术开发基于主机的转录后基因沉默（PTGS）抑制病毒增殖2,3。农杆菌介导的VIGS已被成功地应用在双子叶植物， 如茄科，拟南芥和豆科植物物种的广泛，单子叶植物物种，其中包括大麦，小麦和玉米， 各种功能基因组研究3,4。由于这种快速和有效的方法避免了厂房改造和克服的功能冗余，这是特别有吸引力，适合在作物品种，如棉花不适合转型功能基因组学研究。
在这项研究中，我们报告VIGS在棉花农杆菌介导的系统的详细协议。其中几种病毒的VIGS载体，烟草脆裂病毒（TRV）侵入的主机范围广，能够传遍整个工厂的大力尚未产生症状轻微的hosts5。要监视的沉默效率，GrCLA1 alterados 1基因棉花（AtCLA1），已被克隆，并插入到VIGS二进制向量pYL156。CLA1基因参与叶绿体发展 6，和以往的研究表明，拟南芥 Cloroplastos的同源基因， AtCLA1损失的功能，导致7片真叶白化病的表型，沉默效率提供了一个良好的视觉标记。 农杆菌浸润在大约两个星期后，白化病的表型开始出现片真叶，与100％，在所有实验复制的沉默效率。内源性基因表达的沉默，也证实了RT – PCR分析。值得注意的是，沉默potently可能发生在我们测试的所有品种，包括各种商业化种植的品种在得克萨斯州。这种快速，高效的的农杆菌介导的VIGS检测，提供了一个快速大规模的棉花全基因组水平的基因功能分析非常强大的工具。
Protocol
Discussion
VIGS已被证明是一个瞬时击倒内源性基因的表达，在功能基因组学分析的有力工具。在这项研究中，我们开发利用TRV -基于二进制向量农杆菌介导的VIGS。棉花CLA1（GrCLA1）基因作为一种视觉标记，监察沉默效率。我们一直得到100％的基因沉默的效率，表现出白化病的表型出现在所有品种的片真叶测试，大约两个星期后渗透开始。然而，CLA1沉默的棉花植株难以发展成纤维或种子阶段…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢博士。 SP的Dinesh Kumar和尤尔刘TRV – VIGS载体，和Drs。查Kenerley，特里轮车，吉姆斯塔尔提供棉花种子和拜耳作物科学。这项工作是由NSF资助LS和NIH的PH
Materials
| Name of the reagents and equipments | Company | Catalogue/serial number | Comments |
|---|---|---|---|
| Roller drum | Glas-Col, LLC. | 099A TC108 | Agro-bacterium culture |
| Incubator | Sheldon Manufacturing, Inc. | 01046209 | Agro-bacterium culture |
| UV/Vis spectrophotometer | Beckman Coulter | Model: DU530 | Measuring OD |
| Gene Pulser | BioRad | Model: 1652076; Serial: 154BR3880 | Electroporation |
| Pulser Controller | BioRad | Model: 1652098; Serial: 232BR4833 | Electroporation |
| Micropulser Electroporation cuvette | BioRad | 165-2081 | Electroporation |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 30962 | Inoculation of agro-bacterium |
| Metro Mix 700 | SUNGR | SKU# 553001 | Growing seedling |
| Terra Cotta pot | T.O.Plastics | GPS 3001B2 | Growing seedling |
| MES monohydrate | USB | 18886 | Infiltration buffer |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | Infiltration buffer |
Riferimenti
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