コットンでアグロバクテリウムを介したウイルス誘発遺伝子サイレンシングアッセイ
Summary
我々は、綿のアグロバクテリウムを介したウイルス誘発遺伝子サイレンシング（VIGS）アッセイの詳細なプロトコールを提示する。タバコ茎えそウイルス（TRV）由来VIGSベクターは、RNAが綿GrCLA1、Cloroplastos alterados 1遺伝子のサイレンシング誘導するために配備されました。サイレンGrCLA1によって引き起こさアルビノ表現型は、接種後2週間以内に幼苗期で観察された。
Abstract
コットン（ チョウ目害虫抵抗性ワタ ） が世界中で最も重要な作物の一つです。かなりの努力が、新品種の分子育種が行われている。綿花の大規模な遺伝子機能解析は、ゲノム、遺伝子重複と倍数性、遺伝的形質転換1〜長期成長サイクルと反抗のその大きさに起因する可能性が高い近代的な植物種、の中で最も遅れをとっている。綿の高スループット機能遺伝学/ゲノム研究を容易にするために、我々は、綿の遺伝子機能を評価するために迅速かつ効率的なトランジェントアッセイの開発を試みる。
ウイルス誘導ジーンサイレンシング（VIGS）は、ウイルス増殖2,3を抑制する宿主転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）に基づいて開発された強力な手法です。 Agrobacterium媒介VIGSが正常に様々な機能ゲノム研究の3,4のために、広くそのようなナス科、シロイヌナズナおよびマメ科植物の種などの双子葉植物の種の範囲、及び大麦、小麦、トウモロコシを含む単子葉植物の種に適用されている。この迅速かつ効率的なアプローチは、植物形質転換を回避し、機能的な冗長性を克服するとして、それは特に魅力的と変換のための従順ではない綿のような作物種の機能性ゲノム研究に適しています。
本研究では、我々は、綿のアグロバクテリウムVIGSのシステムの詳細なプロトコールを報告する。いくつかのウイルスVIGSのベクターのうち、タバコのガラガラのウイルス（TRV）がホストの広い範囲に侵入した後、まだhosts5で軽度の症状を作り出すプラント全体にわたって精力的に感染することが可能です。サイレンシングの効率を監視するには、GrCLA1、綿のシロイヌナズナCloroplastos alterados 1遺伝子（AtCLA1）のホモログ遺伝子が、VIGSのバイナリーベクターpYL156中にクローニングし、挿入されている。CLA1遺伝子が葉緑体の開発6、および以前の研究に関与していることはことが示されているAtCLA1の機能喪失効率を黙らせるための優れた視覚的なマーカーを提供する、真の葉7のアルビノ表現型をもたらした。約2週間でポストアグロバクテリウムの浸潤、アルビノ表現型はすべて反復実験で100％のサイレンシングの効率で、真の葉の上に登場し始めました。内因性遺伝子発現のサイレンシングは、RT – PCR分析により確認した。著しく、サイレンシングが強力にテキサス州の様々な商業的に栽培品種を含めて我々がテストしたすべての品種で発生する可能性があります。この迅速かつ効率的なアグロバクテリウムVIGSアッセイは、綿のゲノムワイドなレベルでの遺伝子機能の迅速な大規模解析のための非常に強力なツールが用意されています。
Protocol
Discussion
VIGSは、一時的に内在性遺伝子の発現をノックダウンにより、機能的なゲノミクス解析の強力なツールであることが証明されています。本研究では、我々はTRV -ベースのバイナリーベクターを利用することにより、アグロバクテリウムを介したVIGSを開発した。綿CLA1（GrCLA1）遺伝子サイレンシングの効率を監視するための視覚的なマーカーとして開発されました。我々は一貫して取得し?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、博士に感謝しています。 SPディネッシュ-クマールとユール劉TRV – VIGSのベクトルに対して、と博士。チャックKenerley、テリーウィーラー、ジムスターと綿の種子を提供するためのバイエルクロップサイエンス社。この作品は、PHにLSとNIHにNSFによって資金を供給された
Materials
| Name of the reagents and equipments | Company | Catalogue/serial number | Comments |
|---|---|---|---|
| Roller drum | Glas-Col, LLC. | 099A TC108 | Agro-bacterium culture |
| Incubator | Sheldon Manufacturing, Inc. | 01046209 | Agro-bacterium culture |
| UV/Vis spectrophotometer | Beckman Coulter | Model: DU530 | Measuring OD |
| Gene Pulser | BioRad | Model: 1652076; Serial: 154BR3880 | Electroporation |
| Pulser Controller | BioRad | Model: 1652098; Serial: 232BR4833 | Electroporation |
| Micropulser Electroporation cuvette | BioRad | 165-2081 | Electroporation |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 30962 | Inoculation of agro-bacterium |
| Metro Mix 700 | SUNGR | SKU# 553001 | Growing seedling |
| Terra Cotta pot | T.O.Plastics | GPS 3001B2 | Growing seedling |
| MES monohydrate | USB | 18886 | Infiltration buffer |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | Infiltration buffer |
Riferimenti
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