Agrobacterium-gemedieerde virus-geïnduceerde gen silencing Assay In Cotton
Summary
We presenteren de gedetailleerde protocol voor Agrobacterium-gemedieerde virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) test in katoen. De tabak rammelaar virus (TRV)-afgeleide VIGS vectoren werden ingezet om RNA-silencing van katoen GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gen induceren. De albino fenotype veroorzaakt door zwijgen op te leggen GrCLA1 werd waargenomen bij de zaailing fase binnen 2 weken na inoculatie.
Abstract
Katoen (Gossypium hirsutum) is een van de belangrijkste gewassen ter wereld. Aanzienlijke inspanningen geleverd op moleculaire veredeling van nieuwe rassen. De grootschalige gen functionele analyse in katoen is achtergebleven bij de meeste van de moderne plantensoorten, waarschijnlijk vanwege de grote omvang van het genoom, gen duplicatie en polyploïdie, lange groeicyclus en weerspannigheid aan genetische transformatie 1. Ter bevordering van high-throughput functionele genetische / genomische studie in katoen, proberen we een snelle en efficiënte voorbijgaande assays te ontwikkelen om katoen genfuncties te beoordelen.
Virus-Induced gen silencing (VIGS) is een krachtige techniek die werd ontwikkeld op basis van de host Post-transcriptionele gene silencing (PTGS) van virale proliferatie 2,3 onderdrukken. Agrobacterium-gemedieerde VIGS is met succes toegepast in een breed scala van tweezaadlobbigen soorten zoals Solanaceae, Arabidopsis en peulvruchten soorten, en eenzaadlobbigen soorten, waaronder gerst, tarwe en maïs, voor de verschillende functionele genomische studies 3,4. Aangezien dit een snelle en efficiënte aanpak voorkomt plant transformatie en overwint functionele redundantie, is het bijzonder aantrekkelijk en geschikt voor functionele genomische studie bij de teelt van soorten, zoals katoen niet vatbaar voor transformatie.
In deze studie hebben we het verslag van de gedetailleerd protocol van Agrobacterium-gemedieerde VIGS systeem in katoen. Onder de verschillende virale vectoren VIGS, de tabak rammelaar virus (TRV) binnenvalt een breed scala van hosts en is in staat om krachtig verspreid over de gehele plant nog te produceren milde symptomen op de hosts5. Om het zwijgen op te leggen efficiëntie, GrCLA1, een homoloog gen van Arabidopsis Cloroplastos alterados een gen (AtCLA1) in katoen, is gekloond en ingevoegd in de VIGS binaire vector pYL156. CLA1 gen is betrokken bij de ontwikkeling chloroplast 6, en eerdere studies hebben aangetoond dat de te controleren verlies-van-functie van de AtCLA1 resulteerde in een albino fenotype op echte bladeren 7, biedt een uitstekende visuele marker voor zwijgen efficiency. Op ongeveer twee weken na Agrobacterium infiltratie, de albino fenotype begonnen te verschijnen op de echte bladeren, met 100% silencing-efficiëntie in alle gerepliceerde experimenten. Het zwijgen van endogene genexpressie werd ook bevestigd door de RT-PCR-analyse. Aanzienlijk, kon zwijgen krachtig optreden in alle cultivars die we hebben getest, waaronder verschillende commercieel geteelde rassen in Texas. Deze snelle en efficiënte Agrobacterium-gemedieerde VIGS test levert een zeer krachtige tool voor het snel op grote schaal analyse van gen-functies op genoom-brede niveau in katoen.
Protocol
Discussion
VIGS is bewezen een krachtig instrument in functional genomics analyse worden door tijdelijk kloppen beneden de expressie van endogene genen. In deze studie hebben we een Agrobacterium-gemedieerde VIGS ontwikkeld door gebruik te maken van een TRV-op basis van binaire vector. De katoenen CLA1 (GrCLA1) gen werd ontwikkeld als een visuele marker om het zwijgen efficiëntie te monitoren. We hebben consequent verkregen 100% van gene silencing efficiëntie, blijkt uit het albino fenotype die op de echte bladeren in a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar voor Drs. SP-Dinesh Kumar en Yule Liu voor TRV-VIGS vectoren, en Drs. Chuck Kenerley, Terry Wheeler, Jim Starr en Bayer CropScience voor het leveren van katoenzaad. Dit werk werd gefinancierd door NSF te LS en NIH naar PH
Materials
| Name of the reagents and equipments | Company | Catalogue/serial number | Comments |
|---|---|---|---|
| Roller drum | Glas-Col, LLC. | 099A TC108 | Agro-bacterium culture |
| Incubator | Sheldon Manufacturing, Inc. | 01046209 | Agro-bacterium culture |
| UV/Vis spectrophotometer | Beckman Coulter | Model: DU530 | Measuring OD |
| Gene Pulser | BioRad | Model: 1652076; Serial: 154BR3880 | Electroporation |
| Pulser Controller | BioRad | Model: 1652098; Serial: 232BR4833 | Electroporation |
| Micropulser Electroporation cuvette | BioRad | 165-2081 | Electroporation |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 30962 | Inoculation of agro-bacterium |
| Metro Mix 700 | SUNGR | SKU# 553001 | Growing seedling |
| Terra Cotta pot | T.O.Plastics | GPS 3001B2 | Growing seedling |
| MES monohydrate | USB | 18886 | Infiltration buffer |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | Infiltration buffer |
Riferimenti
- Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes. Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).
- Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. Virus-induced gene silencing. Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).
- Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science. 286, 950-952 (1999).
- Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants. Plant J. 39, 734-746 (2004).
- Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. Virus-induced gene silencing in tomato. Plant J. 31, 777-786 (2002).
- Estevez, J. M., Cantero, A., Romero, C., Kawaide, H., Jimenez, L. F., Kuzuyama, T. Analysis of the expression of CLA1, a gene that encodes the 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway in Arabidopsis. Plant Physiol. 124, 95-104 (2000).
- Mandel, M. A., Feldmann, K. A., Herrera-Estrella, L., Rocha-Sosa, M., Leon, P. CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highly conserved in evolution. Plant J. 9, 649-658 (1996).
- Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt. Plant J. 66, 293-305 (2011).
