Agrobacterium-vermittelte Virus-induced gene silencing Assay In Cotton
Summary
Wir präsentieren Ihnen die ausführlichen Protokoll für Agrobacterium-vermittelten Virus-induzierte Gen-Silencing (VIGS)-Assay in Baumwolle. Der Tabak Rassel-Virus (TRV)-abgeleiteten Vektoren VIGS wurden eingesetzt, um RNA-Silencing von Baumwolle GrCLA1, Cloroplastos alterados 1-Gens zu induzieren. Der Albino-Phänotyp durch Schweigen GrCLA1 verursacht wurde am Keimlingsstadium innerhalb von 2 Wochen nach der Impfung beobachtet.
Abstract
Baumwolle (Gossypium hirsutum) ist eine der wichtigsten Kulturpflanzen weltweit. Erhebliche Anstrengungen wurden auf molekularer Züchtung neuer Sorten gemacht worden. Die groß angelegte Gen funktionelle Analyse in Baumwolle hat hinter den meisten der modernen Pflanzenarten, wahrscheinlich aufgrund seiner Größe von Genom, Gen-Duplikation und Polyploidie, lange Wachstumszyklus und Widerspenstigkeit zu genetischen Transformation 1 wurde zurückgeblieben. Zur Erleichterung der hohen Durchsatz funktionelle genetische / genomische Studie in Baumwolle, versuchen wir eine schnelle und effiziente transienten Assays zu entwickeln, um Baumwolle Genfunktionen zu beurteilen.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) ist eine mächtige Technik, basierend auf dem Host-post-transkriptionelle Gene Silencing (PTGS), um die Vermehrung der Viren 2,3 unterdrücken entwickelt wurde. Agrobacterium-vermittelte VIGS wurde erfolgreich in einer Vielzahl von Dikotyledonen Arten wie Solanaceae, Arabidopsis und Leguminosen angewandt und Monokotyledonen Arten, darunter Gerste, Weizen und Mais, die aus verschiedenen funktionellen Genomik Studien 3,4. Da dies eine schnelle und effiziente Ansatz vermeidet Transformation von Pflanzen und überwindet funktionale Redundanz ist es besonders attraktiv und geeignet für funktionelle Genomik Studie in Nutzpflanzen wie Baumwolle nicht zugänglich für die Transformation.
In dieser Studie berichten wir über die detaillierte Protokoll der Agrobacterium-vermittelte VIGS System in Baumwolle. Unter den verschiedenen viralen Vektoren VIGS, dringt der Tabak Rassel-Virus (TRV) eine breite Palette von Hosts und ist in der Lage, kräftig ausgebreitet über den gesamten Anlagen noch produzieren milde Symptome auf der hosts5. Um die Wirksamkeit beim Verstummen, GrCLA1, ein Homologes Gen aus Arabidopsis Cloroplastos alterados 1-Gen (AtCLA1) in Baumwolle, wurde kloniert und in die VIGS Binärvektor pYL156. Cla1 Gen in Chloroplasten Entwicklung 6 beteiligt sind, und frühere Studien haben gezeigt, Monitor, loss-of-Funktion AtCLA1 führte zu einem Albino-Phänotyp auf Laubblätter 7, bietet eine exzellente visuelle Marker für silencing Effizienz. Bei etwa zwei Wochen nach Agrobacterium Infiltration begann die Albino-Phänotyp auf der Laubblätter erscheinen, mit 100% silencing Effizienz in allen wiederholten Experimenten. Das Schweigen der endogenen Genexpression wurde auch durch RT-PCR-Analyse bestätigt. Bezeichnenderweise konnte silencing potently in allen Sorten haben wir getestet, darunter verschiedene kommerziell angebauten Sorten in Texas auftreten. Diese schnelle und effiziente Agrobacterium-vermittelte VIGS Test liefert ein sehr mächtiges Werkzeug für die schnelle großflächige Analyse von Genfunktionen in Genom-weiten Ebene in Baumwolle.
Protocol
Discussion
VIGS ist nachgewiesen worden, ein mächtiges Werkzeug in der funktionellen Genomanalyse werden durch transiente umzuwerfen der Expression endogener Gene. In dieser Studie entwickelten wir eine Agrobacterium-vermittelte VIGS durch die Verwendung eines TRV-basierten binären Vektor. Die Baumwolle Cla1 (GrCLA1)-Gen wurde als visuelle Marker entwickelt, um die Wirksamkeit beim Verstummen zu überwachen. Wir haben immer 100% der Gen-Silencing Effizienz, durch die Albino-Phänotyp, die auf der echten Blätter in alle…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar, dass Drs. SP Dinesh Kumar-und Yule Liu für TRV-VIGS Vektoren und Drs. Chuck Kenerley, Terry Wheeler, Jim Starr und Bayer CropScience für die Bereitstellung von Baumwollsamen. Diese Arbeit wurde von der NSF, um LS und NIH zur PH finanziert
Materials
| Name of the reagents and equipments | Company | Catalogue/serial number | Comments |
|---|---|---|---|
| Roller drum | Glas-Col, LLC. | 099A TC108 | Agro-bacterium culture |
| Incubator | Sheldon Manufacturing, Inc. | 01046209 | Agro-bacterium culture |
| UV/Vis spectrophotometer | Beckman Coulter | Model: DU530 | Measuring OD |
| Gene Pulser | BioRad | Model: 1652076; Serial: 154BR3880 | Electroporation |
| Pulser Controller | BioRad | Model: 1652098; Serial: 232BR4833 | Electroporation |
| Micropulser Electroporation cuvette | BioRad | 165-2081 | Electroporation |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 30962 | Inoculation of agro-bacterium |
| Metro Mix 700 | SUNGR | SKU# 553001 | Growing seedling |
| Terra Cotta pot | T.O.Plastics | GPS 3001B2 | Growing seedling |
| MES monohydrate | USB | 18886 | Infiltration buffer |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | Infiltration buffer |
Riferimenti
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