커튼에서 Agrobacterium - 중재 바이러스 유발 유전자 입을 분석
Summary
우리는 목화의 Agrobacterium – 중재 바이러스 유발 유전자 입을 (VIGS) 분석에 대한 상세한 프로토콜을 제시한다. 담배 래틀 바이러스 (TRV) – 파생 VIGS 벡터는 면화 GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 유전자의 입을 RNA를 유도하기 위해 배치되었다. 입을 GrCLA1로 인한 흰둥이 표현형은 접종 후 2 주 이내에 세들링 단계에서 관찰되었다.
Abstract
커튼 (고십피움 히르수툼)는 세계적으로 가장 중요한 작물 중 하나입니다. 상당한 노력은 새로운 종류의 분자 육종에되었습니다. 면화의 대규모 유전자 기능 분석은 게놈, 유전자 복제 및 polyploidy, 유전자 변형 1 길이 성장주기와 말을 안들음 자사의 대형에 의한 가능성이 현대 식물 종, 대부분의 뒤에서 느껴지되었습니다. 커튼 높은 처리량 기능 유전자 / 게놈 연구를 촉진하기 위해, 우리는 면화 유전자 기능을 평가하기 위해 신속하고 효율적인 과도 assays을 개발하려고합니다.
바이러스 유도된 유전자 입을 (VIGS)은 바이러스 확산 2,3을 주체할 수있는 호스트 포스트 Transcriptional 진 입을 (PTGS)을 기반으로 개발된 강력한 기술입니다. Agrobacterium – 중재 VIGS가 성공적으로 같은 Solanaceae, Arabidopsis과 콩과의 식물 수종으로 dicots 종의 다양한 적용 및 monocots 수종 다양한 기능적 게놈 연구 3,4을 위해 보리, 밀 및 옥수수를 포함하고 있습니다. 이 신속하고 효율적인 접근법 식물 변환을 피할 수와 기능 중복을 극복로서, 그것은 특히 매력적이고 변화에 대한 의무가없는 목화 같은 작물 종의 기능 게놈 연구에 적합합니다.
본 연구에서는, 우리는 목화의 Agrobacterium – 중재 VIGS 시스템의 상세한 프로토콜을보고합니다. 여러 바이러스 VIGS 벡터 중에서 담배 래틀 바이러스 (TRV)는 호스트의 다양한 침공하고 아직 hosts5에 가벼운 증상을 생산하여 전체 공장을 통해 적극적으로 전파 수 있습니다. 입을 효율, GrCLA1, alterados 1 면화의 유전자 (AtCLA1). CLA1 유전자가 엽록체 개발 6 관여 복제 및 VIGS 이진 벡터 pYL156에 삽입되었으며, 이전의 연구 보여주 Arabidopsis Cloroplastos의 상동체 유전자를 모니터링하는 것을 AtCLA1의 손실 기능은 효율을 입을 수있는 훌륭한 시각적인 마커를 제공하고, 진정한 나뭇잎 7 흰둥이 표현형 결과. 약 이주에 게시 Agrobacterium의 침투, 흰둥이 표현형은 모든 복제 실험에서 100 % 입을 효율, 진정한 나뭇잎에 표시하기 시작했습니다. 내생 유전자 표현의 입을는 RT – PCR 분석에 의해 확인되었다. 크게, 입을는 potently 텍사스 다양한 상업적으로 재배 품종을 포함하여 우리가 테스트한 모든 cultivars에 발생할 수 있습니다. 이것은 신속하고 효율적인 Agrobacterium – 중재 VIGS 분석은 목화의 게놈 – 넓은 수준에서 유전자 기능을 신속하게 대규모 분석을위한 매우 강력한 도구를 제공합니다.
Protocol
Discussion
VIGS은 transiently 내생 유전자의 표현을 쓰러뜨린하여 기능적 게놈 분석에 강력한 도구로 입증되었습니다. 본 연구에서는, 우리는 TRV 기반 이진 벡터를 이용하여 Agrobacterium – 중재 VIGS을 개발했습니다. 커튼 CLA1 (GrCLA1) 유전자는 입을 효율성을 모니터링하는 시각 마커로 개발되었습니다. 우리는 지속적으로 모든 종류의 진정한 나뭇잎에 나타나는 흰둥이 표현형은 약 2 주 게시물 침투로부터 시…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 DRS에게 감사하고 있습니다. SP Dinesh – 쿠마과 율 리우 TRV – VIGS 벡터, 그리고 DRS. 척 Kenerley, 테리 휠러, 짐 스타와 무명의 씨앗을 제공 바이엘 CropScience. 이 작품은 PH에 LS와 NIH에 NSF에 의해 투자되었다
Materials
| Name of the reagents and equipments | Company | Catalogue/serial number | Comments |
|---|---|---|---|
| Roller drum | Glas-Col, LLC. | 099A TC108 | Agro-bacterium culture |
| Incubator | Sheldon Manufacturing, Inc. | 01046209 | Agro-bacterium culture |
| UV/Vis spectrophotometer | Beckman Coulter | Model: DU530 | Measuring OD |
| Gene Pulser | BioRad | Model: 1652076; Serial: 154BR3880 | Electroporation |
| Pulser Controller | BioRad | Model: 1652098; Serial: 232BR4833 | Electroporation |
| Micropulser Electroporation cuvette | BioRad | 165-2081 | Electroporation |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 30962 | Inoculation of agro-bacterium |
| Metro Mix 700 | SUNGR | SKU# 553001 | Growing seedling |
| Terra Cotta pot | T.O.Plastics | GPS 3001B2 | Growing seedling |
| MES monohydrate | USB | 18886 | Infiltration buffer |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | Infiltration buffer |
Riferimenti
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