Agrobacterium בתיווך Virus-induced ג'ין השתקת Assay כותנה
Summary
אנו מציגים את פרוטוקול מפורט עבור Agrobacterium בתיווך וירוס-Induced assay השתקה (VIGS) גנים כותנה. רעשן טבק וירוס (TRV) הנגזרות וקטורים VIGS נפרסו לגרום RNA השתקת GrCLA1 כותנה, Cloroplastos alterados 1 הגן. פנוטיפ לבקן הנגרמת על ידי השתקת GrCLA1 נצפתה בשלב שתיל בתוך 2 שבועות לאחר חיסון.
Abstract
כותנה (Gossypium hirsutum) הוא אחד הגידולים החשובים ביותר בעולם. מאמצים רבים נעשו על הריבוי המולקולרי של זנים חדשים. ניתוח בקנה מידה גדול גן תפקודית כותנה כבר פיגרה רוב מיני הצמחים המודרנית, ככל הנראה בשל גודלו של הגנום, שכפול גנטי polyploidy, מחזור צמיחה סרבנות ארוך לשינוי גנטי 1. כדי להקל על מחקר גנטי גבוה התפוקה / גנומית פונקציונלית כותנה, אנו מנסים לפתח מבחני חולף מהיר ויעיל כדי להעריך את גן פונקציות כותנה.
Virus-induced להשתקת גנים (VIGS) היא טכניקה רבת עוצמה אשר פותחה על בסיס לארח את הפוסט תעתיק להשתקת גנים (PTGS) לדכא התפשטות ויראלית 2,3. Agrobacterium בתיווך VIGS יושם בהצלחה במגוון רחב של מינים dicots כגון Solanaceae, ארבידופסיס ומינים קטניות, מינים monocots כולל שעורה, חיטה, תירס, עבור מחקרים שונים גנומית תפקודית 3,4. כפי גישה זו מהיר ויעיל ימנע שינוי הצמח מתגבר יתירות פונקציונלית, הוא אטרקטיבי במיוחד ומתאימה המחקר הגנומי תפקודית מינים כמו יבול הכותנה לא ניתנות לשינוי.
במחקר זה, אנו מדווחים על פרוטוקול מפורט של מערכת VIGS Agrobacterium בתיווך כותנה. בין וקטורים ויראליים VIGS מספר, טרטור טבק וירוס (TRV) פולש מגוון רחב של המארחים, והוא מסוגל להתפשט נמרצות ברחבי המפעל כולו עדיין לייצר סימפטומים קלים על hosts5. כדי לבדוק את יעילות השתקה, GrCLA1, גן homolog של Cloroplastos ארבידופסיס alterados 1 גן (AtCLA1) כותנה, כבר משובטים ונוסף וקטור בינארי VIGS pYL156. CLA1 גן עוסקת בפיתוח הכלורופלסט 6, מחקרים קודמים הראו כי ההפסד-of-פונקציה של AtCLA1 הביא פנוטיפ לבקן על העלים נכון 7, מתן סמן ויזואלי מצוין השתקה יעילות. בסביבות שבועיים שלאחר חדירת Agrobacterium, את הפנוטיפ לבקן החלו להופיע על העלים נכון, עם יעילות ההשתקה של 100% כל הניסויים משוכפל. השתקה של ביטוי גנים אנדוגניים אושרה גם על ידי ניתוח RT-PCR. ראוי לציין, השתקה potently יכול להתרחש בכל הזנים שנבדקו, כולל זנים מסחריים שונים גדל בטקסס. זה מהיר ויעיל Agrobacterium בתיווך assay VIGS מספק כלי רב עוצמה עבור ניתוח בקנה מידה גדול מהירה של פונקציות גן ברמת הגנום כולו כותנה.
Protocol
Discussion
VIGS הוכח להיות כלי רב עוצמה לניתוח גנומיקה תפקודית על ידי transiently מפילה את הביטוי של גנים אנדוגניים. במחקר זה, פיתחנו Agrobacterium בתיווך VIGS ידי ניצול וקטור TRV מבוססי בינארי. כותנה CLA1 (GrCLA1) גן פותחה כסמן ויזואלי כדי לעקוב אחר יעילות ההשתקה. השגנו בעקביות 100% יעילות השתקת הג…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים בני הזוג. SP-דינש קומאר חג המולד ליו עבור TRV-VIGS וקטורים, ואת בני הזוג. צ'אק Kenerley, טרי וילר, ג'ים סטר ו Bayer CropScience למתן זרעי כותנה. עבודה זו מומנה על ידי LS-NSF ו-NIH ל PH
Materials
| Name of the reagents and equipments | Company | Catalogue/serial number | Comments |
|---|---|---|---|
| Roller drum | Glas-Col, LLC. | 099A TC108 | Agro-bacterium culture |
| Incubator | Sheldon Manufacturing, Inc. | 01046209 | Agro-bacterium culture |
| UV/Vis spectrophotometer | Beckman Coulter | Model: DU530 | Measuring OD |
| Gene Pulser | BioRad | Model: 1652076; Serial: 154BR3880 | Electroporation |
| Pulser Controller | BioRad | Model: 1652098; Serial: 232BR4833 | Electroporation |
| Micropulser Electroporation cuvette | BioRad | 165-2081 | Electroporation |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 30962 | Inoculation of agro-bacterium |
| Metro Mix 700 | SUNGR | SKU# 553001 | Growing seedling |
| Terra Cotta pot | T.O.Plastics | GPS 3001B2 | Growing seedling |
| MES monohydrate | USB | 18886 | Infiltration buffer |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | Infiltration buffer |
Riferimenti
- Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes. Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).
- Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. Virus-induced gene silencing. Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).
- Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science. 286, 950-952 (1999).
- Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants. Plant J. 39, 734-746 (2004).
- Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. Virus-induced gene silencing in tomato. Plant J. 31, 777-786 (2002).
- Estevez, J. M., Cantero, A., Romero, C., Kawaide, H., Jimenez, L. F., Kuzuyama, T. Analysis of the expression of CLA1, a gene that encodes the 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway in Arabidopsis. Plant Physiol. 124, 95-104 (2000).
- Mandel, M. A., Feldmann, K. A., Herrera-Estrella, L., Rocha-Sosa, M., Leon, P. CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highly conserved in evolution. Plant J. 9, 649-658 (1996).
- Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt. Plant J. 66, 293-305 (2011).
