Mediada por Agrobacterium inducida por el virus Gene ensayo silenciamiento en algodón
Summary
Se presenta el protocolo detallado para la mediada por Agrobacterium inducida por el virus de silenciamiento génico (VIGS) de ensayo en el algodón. El virus del cascabel del tabaco (TRV) vectores derivados de VIGS fueron desplegados para inducir el silenciamiento de ARN de algodón GrCLA1, Alterados Cloroplastos un gen. El fenotipo albino causadas por el silenciamiento GrCLA1 se observó en el estado de plántula dentro de 2 semanas después de la inoculación.
Abstract
Algodón (Gossypium hirsutum) es uno de los cultivos más importantes del mundo. Los esfuerzos se han hecho considerables en la reproducción molecular de nuevas variedades. El análisis genético a gran escala funcional de algodón se ha quedado atrás la mayor parte de las especies de plantas modernas, probablemente debido a su gran tamaño de la duplicación del genoma, los genes y la poliploidía, largo ciclo de crecimiento y la obstinación a la transformación genética 1. Para facilitar el estudio funcional de alto rendimiento genética / genómica en algodón, tratamos de desarrollar ensayos transitoria rápida y eficiente para evaluar las funciones de genes de algodón.
Inducida por el virus de silenciamiento génico (VIGS) es una poderosa técnica que fue desarrollada con base en el host post-transcripcional silenciamiento génico (PTGS) para reprimir la proliferación viral 2,3. Mediada por Agrobacterium VIGS ha sido aplicado con éxito en una amplia gama de especies dicotiledóneas como Solanaceae, Arabidopsis y otras especies de leguminosas y especies monocotiledóneas como la cebada, el trigo y el maíz, por diversos estudios de genómica funcional 3,4. Como este método rápido y eficaz evita la transformación de plantas y supera la redundancia funcional, es particularmente atractiva y adecuada para el estudio de genómica funcional en las especies de cultivos como el algodón no es susceptible de transformación.
En este estudio, se presenta el protocolo detallado de Agrobacterium VIGS sistema en el algodón. Entre los varios vectores VIGS viral, el virus del cascabel del tabaco (TRV) invade una amplia gama de huéspedes y es capaz de propagarse con fuerza a lo largo de toda la planta sin embargo, producen síntomas leves en la hosts5. Para controlar la eficacia de silenciamiento, GrCLA1, un gen homólogo de Arabidopsis Cloroplastos Alterados un gen (AtCLA1) en el algodón, ha sido clonado y se inserta en el vector binario VIGS pYL156. CLA1 gen está involucrado en el desarrollo del cloroplasto 6, y estudios previos han demostrado que pérdida de función de AtCLA1 dio lugar a un fenotipo albino de 7 hojas verdaderas, proporcionando un excelente marcador visual para silenciar la eficiencia. En aproximadamente dos semanas después de la infiltración de Agrobacterium, el fenotipo albino comenzaron a aparecer en las hojas verdaderas, con una eficiencia del 100% en silenciar a todos los experimentos replicados. El silenciamiento de la expresión de genes endógenos también fue confirmado por RT-PCR análisis. Significativamente, el silenciamiento potente podría ocurrir en todas las variedades que hemos probado, incluyendo varias variedades cultivadas comercialmente en Texas. Esta rápida y eficiente mediada por Agrobacterium VIGS ensayo proporciona una herramienta muy poderosa para un rápido análisis a gran escala de las funciones de los genes en el genoma de nivel en el algodón.
Protocol
Discussion
VIGS ha demostrado ser una poderosa herramienta en el análisis de la genómica funcional de forma transitoria derribar la expresión de genes endógenos. En este estudio, hemos desarrollado un VIGS mediada por Agrobacterium mediante la utilización de un vector binario TRV-basado. El algodón CLA1 (GrCLA1) gen fue desarrollado como una marca visual para monitorear la eficiencia de silenciamiento. Siempre hemos obtenido el 100% de eficiencia de silenciamiento génico, como lo demuestra el fenotipo albino que ap…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos muy agradecidos a los Dres. SP Dinesh-Kumar y Liu Yule para TRV-VIGS vectores, y los Dres. Chuck Kenerley, Wheeler Terry, Starr y Jim Bayer CropScience para el suministro de semillas de algodón. Este trabajo fue financiado por la NSF para LS y los NIH para PH
Materials
| Name of the reagents and equipments | Company | Catalogue/serial number | Comments |
|---|---|---|---|
| Roller drum | Glas-Col, LLC. | 099A TC108 | Agro-bacterium culture |
| Incubator | Sheldon Manufacturing, Inc. | 01046209 | Agro-bacterium culture |
| UV/Vis spectrophotometer | Beckman Coulter | Model: DU530 | Measuring OD |
| Gene Pulser | BioRad | Model: 1652076; Serial: 154BR3880 | Electroporation |
| Pulser Controller | BioRad | Model: 1652098; Serial: 232BR4833 | Electroporation |
| Micropulser Electroporation cuvette | BioRad | 165-2081 | Electroporation |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 30962 | Inoculation of agro-bacterium |
| Metro Mix 700 | SUNGR | SKU# 553001 | Growing seedling |
| Terra Cotta pot | T.O.Plastics | GPS 3001B2 | Growing seedling |
| MES monohydrate | USB | 18886 | Infiltration buffer |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | Infiltration buffer |
Riferimenti
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- Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. Virus-induced gene silencing. Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).
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