嗅神経細胞のレンチウイルスを介した遺伝子操作と可視化 in vivoで</em
Summary
我々は、単一の嗅覚ニューロンの軸索とその終末分枝の遺伝子操作と可視化のためのレンチウイルス技術を提示<em> in vivoで</em>。
Abstract
正確な嗅覚回路の開発は、嗅球（OB）で、そのシナプスのターゲットへの嗅覚ニューロン（OSN）軸索の正確な投影に依存しています。 OSN軸索の成長と標的の分子メカニズムはよく理解されていない。遺伝子発現を操作すると、単一のOSNの軸索とその終末の形態の可視化、その後のことはこれまでに挑戦されている。指定された時間フレーム内の単一細胞レベルでの遺伝子機能を調べるために、我々は、in vivoで OSNsで遺伝子発現を操作するレンチウイルスベースの技術を開発。レンチウイルス粒子は、嗅上皮（OE）にマイクロインジェクションによってOSNsに配信されます。発現カセットは、その後、恒久的に形質導入OSNsのゲノムに組み込まれている。緑色蛍光タンパク質の発現は、感染したOSNsを識別し、軸索終末分を含めて、彼らの全体の形態の概要を説明します。マイクロインジェクションし、レポーターの検出との間の短いターンアラウンドタイムのために、遺伝子機能の研究は、開発の非常に狭い期間内に集中することができます。この方法では、我々は、3日間、わずか三ヶ月限り、次の注入内でGFPの発現を検出した。私たちは、ノックダウンレンチウイルスマイクロインジェクションによって媒介過剰発現やshRNAの両方を達成している。このメソッドは、 生体内での単一細胞レベルでのOSN細胞体と軸索の詳細な形態を提供するため、嗅覚、開発中の候補遺伝子の機能の特性評価が可能になります。
Protocol
Discussion
OSNゲノムDNAに遺伝子構築物の永久的な移転のレンチウイルスの結果のマイクロインジェクション。このアプローチは、私たちは過剰発現またはshRNAを介したノックダウンを経由して候補遺伝子の短期または長期の操作を実行することができます。さらに、我々は蛍光嗅覚受容体の個体群の共局在を観察するために、既存のトランスジェニックマウスのラインで単一のOSNsにラベルを付けること…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究では、BSにQGとT32 – DC008072にNIH DC052256とDC006015、およびNSF 0324769によってサポートされています。
Materials
Microinjection: Newborn mice were microinjected using a 5μL Hamilton syringe (Hamilton #7647-01) fitted with a 33 gauge needle (Hamilton #7762-06).
Immunocytochemistry Reagents: Primary antibodies: rabbit polyclonal antibody GFP (Molecular Probes# A-6455), chicken polyclonal antibody against OMP (custom) (Chen et al., 2005), guinea pig polyclonal antibody against VGlut2 (Millipore# AB2251). Secondary antibodies: Cy2-conjugated donkey anti-rabbit (Jackson Immunolab# 711-225-152), Cy3-conjugated donkey-anti-chicken (Jackson Immunolab# 703-165-155) and Cy5-conjugated goat anti-guinea pig (Jackson Immunolab# 106-175-008). Sections were mounted on glass slides with Fluoromount G (Southern Biotech# 0010-01) with 50ng/mL DAPI chromatin stain solution.
Confocal Imaging: Z-stack images were taken using an Olympus Flouview FV1000 confocal microscope and images collected and processed into 3D projections using Olympus FV10-ASW 2.01 confocal acquisition and analysis software.
Riferimenti
- Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor. J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).
- Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study. Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).
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- Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo. J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).
