Diversi 2'-Fluoro aptameri contro l'HIV-RNA 1BA-L gp120 con nanomole affinità sono isolati da una libreria di RNA In vitro Procedura SELEX. Un nuovo doppio inibitoria funzione anti-gp120 aptamer-siRNA chimera si crea e mostra la promessa considerevole sistemico terapia anti-HIV.
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Articolo metodologico
Sviluppo di Cell-tipo specifico anti-HIV gp120 aptameri per la consegna di siRNA
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'epidemia globale di infezione da HIV ha creato un urgente bisogno di nuove classi di farmaci antiretrovirali. La capacità potente di small interfering (si) RNA di inibire l'espressione di trascrizioni di RNA complementare viene sfruttato come una nuova classe di terapie per una varietà di malattie tra cui l'HIV. Molti rapporti precedenti hanno dimostrato che nuove strategie a base di RNAi anti-HIV/AIDS terapeutiche sono molto promettente, ma uno dei principali ostacoli per l'applicazione di successo terapeutico e la traduzione clinica di siRNA è la consegna efficiente. In particolare, considerando la sicurezza e l'efficacia di terapie a base di RNAi, è altamente auspicabile per sviluppare un approccio mirato intracellulare consegna di siRNA a popolazioni di cellule o tessuti specifici. L'HIV-1 proteina gp120, una busta glicoproteina sulla superficie del virus HIV-1, svolge un ruolo importante in ingresso del virus nelle cellule CD4. L'interazione di gp120 e CD4 che innesca l'HIV-1 ingresso e avvia la fusione cellulare è stato convalidato come clinicamente rilevante anti-virale strategia di scoperta di nuovi farmaci.
Qui, abbiamo innanzitutto discutere la selezione e l'individuazione di 2'-F modificato anti-HIV gp120 aptameri RNA. Utilizzando un metodo convenzionale SELEX filtro di nitrocellulosa, diversi aptameri nuovo con affinità nanomolare sono stati isolati da un 50 casuale nt RNA biblioteca. Al fine di ottenere con successo le specie legate con maggiore affinità, il rigore selezione viene accuratamente controllato regolando le condizioni. Il aptameri selezionato può legano specificamente ed essere rapidamente internalizzato nelle cellule che esprimono la proteina di HIV-1 busta. Inoltre, il aptameri sola può neutralizzare l'infettività di HIV-1. Sulla base della miglior aptamer A-1, abbiamo anche creato un romanzo a doppia funzione inibitoria anti-gp120 aptamer-siRNA chimera in cui sia il aptamer e le porzioni siRNA hanno potente attività anti-HIV. Inoltre, utilizziamo la gp120 aptamer-siRNA chimere per cellulari tipo di consegna specifiche del siRNA HIV-1 in cellule infette. Questa doppia funzione chimera indica un notevole potenziale per la combinazione di diversi agenti terapeutici degli acidi nucleici (aptamero e siRNA), nella soppressione da HIV-1, rendendo il aptamer-siRNA chimere attraente candidati terapeutici per i pazienti non aver terapia antiretrovirale altamente attiva (HAART).
Protocollo
1. Preparazione della libreria di RNA
- La libreria di DNA di partenza conteneva 50 nucleotidi di sequenze casuali ed è stato sintetizzato da Integrated Technologies DNA (Iowa City, Iowa). Il singolo filamento di DNA sequenza biblioteca oligo è 5'-GGG AGG ATG ACG CGG - N 50 - CAG ACG ATTO CGC CCG A - 3 '(81 nt). La regione a caso è fiancheggiato da regioni costanti, tra cui il promotore T7 per la trascrizione in vitro e tag a 3 'per RT-PCR. 5 'e 3' delle sequenze costanti sono 5 '- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GGA CGA TGC GG - 3' (32 mer) e 5 'TCG GGC-GAG TCG TCT G - 3' (16 mer), rispettivamente. Fai la soluzione madre con acqua e conserva....
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Discussione
Aptameri sono evoluti in vitro degli acidi nucleici che assumono specifiche e stabili forme tridimensionali, fornendo in tal modo altamente specifico, legame stretto di molecole mirate 8. La bassa affinità nanomolare legame e specificità squisita aptameri ai loro obiettivi li rendono strumenti versatili per la diagnostica, imaging in vivo, e terapie 9. Con l'avvento della tecnologia per la consegna aptamer siRNA mirate è ora possibile utilizzare la funzione aptamer vincolante .......
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Dichiarazioni
J. R e JZ hanno richiesto il brevetto per "Cell-tipo specifico aptamer-siRNA sistema di consegna per l'HIV-1 terapia". USPTO, n. 12/328994, Data di pubblicazione: 11 giugno 2009.
Ringraziamenti
Ringraziamo Britta Hoehn, Guihua Sole, Harris Soifer e Lisa Scherer per utili discussioni. Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institutes of Health AI29329 e HL07470 assegnato a JJR I seguenti reagenti sono stati ottenuti attraverso la ricerca e l'AIDS NIH reagente Reference Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: La CHO-EE e CHO-gp160 cellulare linea, il pNL4-3 luc vettoriale; HIV-1 BAL gp120 da DAIDS, NIAID.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| MF-Millipore membrana del filtro | Millipore | HAWP01300 | Dimensione dei pori 0,45 micron |
| Swinnex portafiltro | Millipore | SX0001300 | 13 millimetri di diametro |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | Purificazione del DNA |
| Microcontrollore YM-30 colonna | Millipore | 42410 | RNA concentrazione |
| Bio-spin 30 colonne | Bio-Rad | 732-6250 | RNA purificazione |
| PCR Taq DNA polimerasi | Sigma-Aldrich | D1806 | |
| ThermoScript RT-PCR sistema | Invitrogen | 11146-024 | |
| DuraScribe Kit di trascrizione T7 | Epicentre | DS010925 | |
| dNTP per PCR | Roche | 1 581 295 | |
| Acido ribonucleico, trasferimento da E.coli | Sigma-Aldrich | R1753 | tRNA concorrente |
| HIV-1 Ba-L proteina gp120 | la ricerca AIDS e reagente Reference Program | 4961 | Proteina bersaglio |
| Silenziatore etichettatura kit siRNA - Cy3 | Ambion | 1632 | |
| Acido fenolo / cloroformio 5 / 1 soluzione (pH 4,5) | Ambion | AM9720 | |
| Cloroformio / isopropanolo 24 / 1 soluzione | Sigma | C0549 | |
| Vitello fosfatasi intestinali (CIP) | New England BioLab | M0290L | |
| T4 chinasi polinucleotide | New England BioLab | M0201L | |
| Glicogeno | Roche | 10 901 393 001 | RNA precipitazioni |
| Gamma-P 32-ATP | MP Biomedica | 013502002 | Radiactivity |
| 40% AccuGel 19:01 | Nazionale di diagnostica | CE-850 | |
| 10xTBE | Nazionale di diagnostica | CE-860 | |
| N, N, N, N-Tetramethylethylenediamine (TMEMD) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Di ammonio persolfato (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| L-methioine sulfoximine | Sigma-Aldrich | M5379-250 mg | |
| RPMI media 1640 | Invitrogen | 11835-030 | |
| Bicarbonato di sodio, 7,5% w / v | Invitrogen | 25080-094 | |
| Minimo Medium (MEM) (10 ) | Invitrogen | 11430-030 | |
| MEM non essenziali aminoacido (100 ) | Invitrogen | 11140-050 | |
| TA clonazione kit con pCR 2,1 | Invitrogen | K2040-01 |
Riferimenti
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. <....
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Ristampe e permessi
