En standardiserad metod för att förbereda vuxna<em> Drosophila</em> Ögon för semi-tunna sektionering och lätt mikroskopisk analys presenteras här. Protokollet kan användas för grov morfologisk analys av ögat defekter, eller med de angivna justeringar kan användas för att bestämma genetiska kraven för gener i specifika celltyper i ögat (t.ex. klonal analys av fotoreceptorer) eller för elektronmikroskopiska analys.
Drosophila har länge använts som modellsystem för att studera utvecklingen, främst på grund av den lätthet med vilken den genetiskt lätthanterlig. Under åren har en uppsjö av muterade stammar och tekniska trick tagits fram för att möjliggöra sofistikerade frågor ställas och besvaras inom rimlig tid. Grundläggande insikt i samspelet mellan komponenterna i alla kända viktiga signalvägar har erhållits framåt och bakåt genetiska Drosophila studier. Flugan ögat har visat sig vara ovanligt väl lämpad för mutationsstatus analys, eftersom, i laboratorium, kan flugor överleva utan fungerande ögon. Dessutom är ytan på insekten ögat består av cirka 800 enskild enhet ögon (facetter eller ommatidia) som bildar en regelbunden, slät yta när tittade på under ett dissekera mikroskop. Därför är det lätt att se om en mutation kan påverka ögonens utveckling och tillväxt genom externt leta efter förlusten av den släta ytan ("grov öga" fenotyp, Fig. 1.) Eller övergripande öga storlek, respektive (för exempel på skärmar baserade på externa ögon morfologi se t.ex. 1). Efterföljande detaljerade analyser av ögat fenotyper kräver fixering, plast bädda och tunna sektionering av vuxna ögon.
Den Drosophila ögat utvecklas från den så kallade öga imaginal skiva, en påse av epitelceller att föröka sig och skilja under larver och PUPP-steg (för granskning se t ex 2). Varje ommatidium består av 20 celler, varav åtta fotoreceptorer (PR eller R-celler;. Fig. 2), fyra objektiv celler som utsöndrar kon, celler pigment ("Hexagons runt R-cell kluster) och en borste. Den fotoreceptorer i varje ommatidium, lättast identifieras genom sina ljuskänsliga organeller, den rhabdomeres, är organiserade i en trapets som består av de sex "yttre" (R1-6) och två "inre" fotoreceptorer (R7 / 8; R8 [Fig. . 2] under R7 och därför endast ses i sektioner från djupare delar av ögat). Den trapetsformade av varje aspekt är just i linje med de av sina grannar och det övergripande anteroposterior och dorsoventral axlar i ögat (Fig. 3A). I synnerhet ommatidia av rygg-och ventrala (svarta och röda pilar, respektive) halvorna av ögat är spegelbilder av varandra och motsvarar två kirala formerna etablerades under planar cell polaritet signalering (för granskning se t.ex. 3).
Metoden att generera halv-tunna ögat sektioner (t.ex. de som presenteras i fig. 3). Beskrivs här är något modifierad från en ursprungligen beskrivs av Tomlinson och Ready 4. Det gör att morfologisk analys av alla celler utom den transparenta kon celler. Dessutom kan pigmentet av R-celler (blå pilspetsar i bild. 2 och 3) kan användas som en cell-autonoma markör för genotypen av en R-cell, och därmed genetiska kraven på gener i en delmängd av R-celler kan lätt bestämmas 5,6.
Att använda Drosophila som modell, genetiska skärmar lett till identifiering av många av de grundande medlemmarna av genfamiljer viktigt för de flesta av de starkt konservativa signalvägar i högre eukaryoter, inklusive människan. Sedan, under laboratorieförhållanden, är en funktionell öga umbärliga för att överleva, är ögat ett särskilt väl lämpad vävnad för upptäckten av nya genfunktioner och bedömning av genetiska nätverk. Ultrastrukturella analys av flugan ögat med hjälp av den beskrivna metoden ledde därmed till grundläggande upptäckter som är relevanta för utveckling och sjukdom. Inledningsvis var enda cell klonal analys utförs med hjälp av röntgen-inducerad kloner kombinerat med kända närstående cell-autonoma recessiv markörer. På senare tid har tillgången på FLP / FRT-systemet för att skapa kloner underlättas avsevärt fenotypisk analys av dödliga mutationer i ögat avsnitt 6,9.
Analys av ögat avsnitt är inte begränsat till tangentiella avsnitt beskrivs här. Om så önskas kan huvudena anpassas i någon riktning i formarna och tvärgående sektioner kan fås att studera djupare skikt i huvudet som lamina och märgen. Protokollet som beskrivs här är alltså en mångsidig metod för analys av ögat och huvudet strukturer Drosophila vuxna.
The authors have nothing to disclose.
Jag vill tacka Dr Jennifer Curtiss för bilderna i figur. 1 och Jeremy Fagan och Dr Florence Marlow för kritiskt läsa manuskriptet. Vårt arbete stöds av NIH bidrag 1R01GM088202.
General equipment:
Fixation solutions:
Glutaraldehyde and OsO4 are highly toxic and should be handled with extreme care in a well-ventilated hood. Use filter tips when handling OsO4 to prevent blackening of your pipette.
Dehydration: Make 30%, 50%, 70%, (80%), 90%, and 100% ethanol solutions. Preferably cool 30%, 50%, 70% ethanol on ice before use.
Staining solution:
1% Toluidine-blue in 1% Borax.
Soft | Hard | |
---|---|---|
Resin A | 54g | 50g |
Hardener B | 44.5g | 50g |
Accelerator C | 2.5g | 1.75g |
Plasticizer D | 10g | 0.75g |
Table 1. Resin preparation
To prepare the resin, carefully, but thoroughly mix all ingredients in a plastic beaker using a magnetic stirrer with a large stir bar. Avoid bubbles. After mixing, aliquot in standard scintillation vials or similar containers and freeze at -20°C. Use soft resin for all applications unless your EM facility asks for the harder formulation. Use gloves to handle resin (carcinogenic in its unpolymerized form). To polymerize resin on equipment and waste, bake at 70°C overnight. Waste may then be safely discarded and equipment cleaned and reused. Spilled unpolymerized resin can be cleaned with isopropanol.
Reagent | Supplier | Catalog number |
---|---|---|
Fly pad | e.g. Genesee | 59-119 |
Glutaraldehyde | Sigma | G7526-10 X 10 ML |
OsO4 | Polysciences,Inc. | 0972A-20 |
Propyleneoxide | Fisher | 04332-1 |
Scalpel handles, for #3 | Fisher | 22080046 |
Scalpel blades #11 | Fisher | 08-916-5B |
Transfer pipettes | Fisher | 13-711-7M |
Durcupan (R) ACM resin | Sigma (Fluka) | 44610-1EA |
Steel dissecting needle | Fisher | S17346 |
BEEM flat embedding mold | Electron Microscopy Sci. | 70904-12 |
Teflon coated razor blades | Electron Microscopy Sci. | 71970 |
Q-tip (sterile swabs) | Fisher | 14-959-81 |
Glass slides | Fisher | 12-550-143 |
Cover slips No 1, 22X60 mm | Fisher | 12-531K |
Gelatin | Fisher | ICN96010280 |
Cr(III) K SO4 dodecahydrate | Sigma | 243361 |
Diamond Histo knife, 6mm | Diatome US | 60-His |
Toluidine Blue O | Fisher | BP107-10 |
Borax (Na-Tetraborate) | Fisher | AC20629-1000 |
DPX mounting medium | Sigma | 44581-100ML |
Table 2. Materials