Protein Membran Kaplama Testi: Çözünür ve çözünmez Proteinler Arasında Etkileşim Test Protokolü In vitro</em
Summary
Test protein-protein etkileşim protein işlevsellik diseksiyon için vazgeçilmezdir. Burada, bir tanıtmak<em> In vitro</emÇözünen bir protein ile bir zar hareketsiz protein prob> protein-protein bağlayıcı tahlil. Bu testte, çözünmeyen bir protein ve çözüm bir protein arasındaki ilişkiyi test etmek için güvenilir bir yöntem sağlar.
Abstract
Validating farklı proteinler arasındaki etkileşimleri, moleküler düzeyde kendi biyolojik fonksiyonları incelenmesi için hayati önem taşımaktadır. Proteine bağlanma in vitro ve in vivo olarak değerlendirmek için, çeşitli yöntemler vardır ve birbirlerinin eksikliklerini tamamlayacak en az iki yöntem güvenilir bilgiler elde etmek için yapılmalıdır.
In vivo tayininde, iki moleküllü floresan tamamlama (BiFC) tayini, canlı hücre içerisinde protein-protein etkileşimleri algılamasını sağlar en popüler ve en az invaziv bir yaklaşımı temsil ediyor, hem de etkileşen proteinler 1,2, hücre içi lokalizasyonu belirlemek için. Bu testte, GFP veya türevleri olmayan floresan K ve C-terminal yarıya iki füzyon proteinleri test proteinler 'etkileşimleri nedeniyle bir araya getiren ne zaman test proteinler erimiş, ve floresan sinyal 3-6 sulandırılmış. . Çünkü sinyali Epifloresans veya konfokal mikroskobu ile kolayca tespit edilebilir, BiFC hücre biyologlar arasında seçim canlı hücreler 3 protein-protein etkileşimleri hakkında eğitim için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu testte, ancak, bazen yalancı pozitif sonuç üretebilir. Örneğin, floresan sinyal daha ziyade bu spesifik etkileşimler nedeniyle 7, küçük bir hücre içi kompartmanda ambalaj yakın nedeniyle her bildiğim kadarıyla 7 nm düzenlenmiş iki GFP parçaları ile sulandırılmış olabilir.
Bu sınırlamalar nedeniyle, canlı hücre görüntüleme teknolojilerinden elde edilen sonuçlar, protein etkileşimleri tespit etmek için farklı bir prensip dayalı bağımsız bir yaklaşım tarafından teyit edilmelidir. Co-immunoprecipitation (Co-IP) ya da glutatyon transferaz (GST) açılan deneyleri, in vitro protein-protein etkileşimleri analiz etmek için yaygın olarak kullanılır gibi alternatif yöntemler temsil eder. Ancak, bu testlerin iin, ancak, test edilen proteinleri bağlama reaksiyon supportsused tampon kolayca çözünür olmalıdır. Bu nedenle, spesifik etkileşimler çözünmeyen bir protein içeren bu tekniklerin tarafından değerlendirilmelidir.
Burada, biz bu zorluğu circumvents protein membran kaplama bağlayıcı testi için protokol göstermektedir. Bu teknikte, çözünür ve çözünmez proteinler arasındaki etkileşim, bir zar matriks proteinleri biri üzerinde hareketsiz çünkü güvenilir bir şekilde test edilebilir. Bu yöntem, in vivo deneyler, bu tür BiFC ile birlikte, sadakatle çözünür ve çözünmez proteinler arasındaki etkileşimleri incelemek ve karakterize etmek için güvenilir bir yaklaşım sağlar. Bu makalede, Tütün mozaik virüsü (TMV) arasında viral hücre-hücre 8-14 taşıma sırasında birden çok işlevi uygular hareket protein (MP), ve kısa bir süre önce tanımlanmış bitki hücresel interactor, tütün ankyrin tekrar içeren protein bağlama (ANK 15), bu tekniği kullanarak gösterilmiştir.
Protocol
Discussion
Bu yaklaşım, proteinler en az bağlayıcı tampon kolayca çözünür olduğu ve diğer proteinlerin kombinasyonu 17,18 başarıyla uygulandı proteinler kombinasyonları arasında protein-protein etkileşimleri, test etmek için uygundur . Bu koşullar altında hem de çözünmez proteinler arasındaki iInteractions Bu protokol tarafından test edilemez.
Ayrıca, başarılı refolding ProIM testi için kritik öneme sahiptir. Kalan SDS denatürasyon / Yeniden doğallaştırman?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Laboratuarda çalışma NIH, ABD Tarım Bakanlığı Gıda ve Tarım Ulusal Enstitüsü, NSF, BARD, Enerji Bakanlığı ve BSF VC hibe tarafından desteklenmektedir
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 |
| Proteinase inhibitor cocktail | SIGMA | S8820 |
| Mini-PROTEAN system | Bio-RAD | 165-8000 |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-RAD | 170-3940 |
| Anti-rabbit IgG antibody conjugated with horse radish peroxidase | GenScript | A00098 |
| Anti-GST rabbit polyclonal antibody | GenScript | A00097 |
| Anti-strepII | GenScript | A00626 |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Scientific | 27377-000 |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | Millipore | WBKL S0 050 |
Riferimenti
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9, 789-798 (2002).
- Citovsky, V. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. J Mol Biol. 362, 1120-1131 (2006).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Shyu, Y. J. Visualization of protein interactions in living Caenorhabditis elegans using bimolecular fluorescence complementation analysis. Nat Protoc. 3, 588-596 (2008).
- Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta. Methods. 45, 196-206 (2008).
- Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).
- Zamyatnin, A. A. Assessment of the integral membrane protein topology in living cells. Plant J. 46, 145-154 (2006).
- Citovsky, V., Knorr, D., Schuster, G., Zambryski, P. C. The P30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein. Cell. 60, 637-647 (1990).
- Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science. 270, 1983-1985 (1995).
- Tomenius, K., Clapham, D., Meshi, T. Localization by immunogold cytochemistry of the virus coded 30 K protein in plasmodesmata of leaves infected with tobacco mosaic virus. Virology. 160, 363-371 (1987).
- Ding, B. Secondary plasmodesmata are specific sites of localization of the tobacco mosaic virus movement protein in transgenic tobacco plants. Plant Cell. 4, 915-928 (1992).
- Meshi, T. Function of the 30 kd protein of tobacco mosaic virus: involvement in cell-to-cell movement and dispensability for replication. EMBO J. 6, 2557-2563 (1987).
- Wolf, S., Deom, C. M., Beachy, R. N., Lucas, W. J. Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit. Science. 246, 377-379 (1989).
- Waigmann, E., Lucas, W. J., Citovsky, V., Zambryski, P. C. Direct functional assay for tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein and identification of a domain involved in increasing plasmodesmal permeability. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 1433-1437 (1994).
- Ueki, S., Spektor, R., Natale, D. M., Citovsky, V. ANK, a host cytoplasmic receptor for the Tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein, facilitates intercellular transport through plasmodesmata. PLoS Pathog. 6, e1001201-e1001201 (2010).
- Coligan, J. E., Dunn, B. M., Ploegh, H. L., Speicher, D. W., Wingfield, P. T., Taylor, G. . , (2011).
- Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. VIP1, an Arabidopsis protein that interacts with Agrobacterium VirE2, is involved in VirE2 nuclear import and Agrobacterium infectivity. EMBO J. 20, 3596-3607 (2001).
- Chen, M. H., Sheng, J., Hind, G., Handa, A., Citovsky, V. Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement. EMBO J. 19, 913-920 (2000).
