الفحص البروتين تراكب الأغشية : بروتوكول لاختبار التفاعل بين البروتينات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان في المختبر</em
Summary
لا غنى عن اختبار البروتين البروتين التفاعل لتشريح وظيفة البروتين. هنا ، نحن بتقديم و<em> في المختبر</em> البروتين البروتين فحص ملزمة ليشمل التحقيق في غشاء من البروتين ثبتوا مع بروتين قابل للذوبان. هذا الاختبار يوفر طريقة موثوق بها لاختبار التفاعل بين البروتينات غير قابلة للذوبان وبروتين في الحل.
Abstract
التحقق من التفاعلات بين البروتينات المختلفة أمر حيوي لتحقيق وظائفها البيولوجية على المستوى الجزيئي. هناك أساليب عدة ، سواء في التجارب المختبرية والحية ، لتقييم ملزمة البروتين ، وينبغي أن تجرى على الأقل طريقتين التي تكمل بعضها البعض أوجه القصور في الحصول على رؤى وثوقية.
لمقايسة في الجسم الحي ، وتكامل ثنائي الجزيء مضان (BiFC) مقايسة يمثل النهج الأكثر شعبية والأقل الغازية التي تمكن للكشف عن البروتين البروتين التفاعل داخل الخلايا الحية ، وكذلك تحديد توطين الخلايا من 1،2 البروتينات المتفاعلة. في هذا الاختبار ، وتنصهر غير الفلورسنت N – C ومحطة GFP – نصفي أو مشتقاته للبروتينات اختبار ، وعندما يتم إحضارها بروتينات اندماج اثنين معا بسبب تفاعلات البروتينات اختبار "، يتم إعادة تشكيل إشارة الفلورسنت 3-6 . بسبب اشارة غير قابلة للكشف بسهولة عن طريق الفحص المجهري أو epifluorescence مبائر ، برز BiFC كأداة قوية من الاختيار بين علماء الأحياء خلية لدراسة عن بروتين تفاعلات البروتين في الخلايا الحية 3. هذا الاختبار ، ومع ذلك ، يمكن ان تنتج في بعض الأحيان إلى نتائج إيجابية كاذبة. على سبيل المثال ، يمكن تشكيل لإشارة الفلورسنت بشظايا GFP two رتبت بقدر 7 نانومتر من بعضها البعض بسبب إغلاق التعبئة والتغليف في المحفظة أ التحت خلوية صغيرة ، وأنه بدلا بسبب تفاعلات معينة 7.
بسبب هذه القيود ، يجب تأكيد النتائج التي تم الحصول عليها من تقنيات التصوير الخلية الحية بنهج مستقل يقوم على مبدأ مختلفة للكشف عن تفاعلات البروتين. شارك في مناعي (المشارك IP) أو الجلوتاثيون ترانسفيراز (GST) المنسدلة المقايسات تمثل هذه الطرق البديلة التي يشيع استخدامها لتحليل التفاعلات بين البروتينات والبروتين في المختبر. ومع ذلك ، IIN هذه المقايسات ، ومع ذلك ، يجب أن تكون قابلة للذوبان البروتينات اختبارها بسهولة في المنطقة العازلة التي supportsused للتفاعل ملزمة. لذا ، لا يمكن أن تنطوي على تفاعلات معينة غير قابلة للذوبان البروتين يتم تقييمها بواسطة هذه التقنيات.
هنا ، نحن لتوضيح بروتوكول للتراكب فحص غشاء بروتين ملزمة ، والتي تلتف على هذه الصعوبة. في هذه التقنية ، يمكن التفاعل بين البروتينات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان اختبار موثوق لأنه يجمد واحد من البروتينات على مصفوفة الغشاء. هذا الأسلوب ، في تركيبة مع التجارب المجراة في مثل BiFC ، يقدم نهجا موثوق بها للتحقيق في وتوصيف التفاعلات بين البروتينات بإخلاص للذوبان وغير القابلة للذوبان. في هذه المقالة ، الربط بين فيروس موزاييك التبغ (TMV) البروتين حركة (MP) ، التي تمارس وظائف متعددة أثناء النقل الخلية الى خلية الفيروسية 8-14 ، والنباتات التي تم تحديدها مؤخرا interactor الخلوية ، والتبغ ankyrin تكرار المحتوية على البروتين (عنخ ويتجلى) 15 ، وذلك باستخدام هذه التقنية.
Protocol
Discussion
هذا النهج هو مناسبة لاختبار البروتين البروتين التفاعلات بين مجموعات من البروتينات ، عندما تم تطبيقها بنجاح واحد على الأقل من البروتينات التي تذوب بسهولة في المخزن ملزمة ، ومجموعة أخرى من البروتينات 17،18. لا يمكن iInteractions بين البروتينات التي هي غير قابلة للذوبان …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم العمل في المختبر لدينا من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة ، وزارة الزراعة والمعهد الوطني للأغذية والزراعة ، وجبهة الخلاص الوطني ، بارد ، وزارة الطاقة ، والبنك السعودي الفرنسي لVC
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 |
| Proteinase inhibitor cocktail | SIGMA | S8820 |
| Mini-PROTEAN system | Bio-RAD | 165-8000 |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-RAD | 170-3940 |
| Anti-rabbit IgG antibody conjugated with horse radish peroxidase | GenScript | A00098 |
| Anti-GST rabbit polyclonal antibody | GenScript | A00097 |
| Anti-strepII | GenScript | A00626 |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Scientific | 27377-000 |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | Millipore | WBKL S0 050 |
Riferimenti
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9, 789-798 (2002).
- Citovsky, V. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. J Mol Biol. 362, 1120-1131 (2006).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Shyu, Y. J. Visualization of protein interactions in living Caenorhabditis elegans using bimolecular fluorescence complementation analysis. Nat Protoc. 3, 588-596 (2008).
- Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta. Methods. 45, 196-206 (2008).
- Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).
- Zamyatnin, A. A. Assessment of the integral membrane protein topology in living cells. Plant J. 46, 145-154 (2006).
- Citovsky, V., Knorr, D., Schuster, G., Zambryski, P. C. The P30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein. Cell. 60, 637-647 (1990).
- Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science. 270, 1983-1985 (1995).
- Tomenius, K., Clapham, D., Meshi, T. Localization by immunogold cytochemistry of the virus coded 30 K protein in plasmodesmata of leaves infected with tobacco mosaic virus. Virology. 160, 363-371 (1987).
- Ding, B. Secondary plasmodesmata are specific sites of localization of the tobacco mosaic virus movement protein in transgenic tobacco plants. Plant Cell. 4, 915-928 (1992).
- Meshi, T. Function of the 30 kd protein of tobacco mosaic virus: involvement in cell-to-cell movement and dispensability for replication. EMBO J. 6, 2557-2563 (1987).
- Wolf, S., Deom, C. M., Beachy, R. N., Lucas, W. J. Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit. Science. 246, 377-379 (1989).
- Waigmann, E., Lucas, W. J., Citovsky, V., Zambryski, P. C. Direct functional assay for tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein and identification of a domain involved in increasing plasmodesmal permeability. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 1433-1437 (1994).
- Ueki, S., Spektor, R., Natale, D. M., Citovsky, V. ANK, a host cytoplasmic receptor for the Tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein, facilitates intercellular transport through plasmodesmata. PLoS Pathog. 6, e1001201-e1001201 (2010).
- Coligan, J. E., Dunn, B. M., Ploegh, H. L., Speicher, D. W., Wingfield, P. T., Taylor, G. . , (2011).
- Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. VIP1, an Arabidopsis protein that interacts with Agrobacterium VirE2, is involved in VirE2 nuclear import and Agrobacterium infectivity. EMBO J. 20, 3596-3607 (2001).
- Chen, M. H., Sheng, J., Hind, G., Handa, A., Citovsky, V. Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement. EMBO J. 19, 913-920 (2000).
