タンパク質のメンブレンオーバーレイアッセイ：可溶性および不溶性タンパク質間の相互作用をテストするためのプロトコル in vitroで</em
Summary
テストのタンパク質 – タンパク質相互作用は、タンパク質の機能の解離のために不可欠である。ここでは、導入<em> in vitroで</em可溶性タンパク質と膜固定化タンパク質を調べるために>タンパク質 – タンパク質結合アッセイ。このアッセイは、不溶性タンパク質と溶液中のタンパク質間の相互作用をテストするために信頼性の高い方法を提供する。
Abstract
異なるタンパク質間の相互作用を検証することは、分子レベルでそれらの生物学的機能の研究に不可欠です。そこに結合タンパク質を評価するためのin vitroおよび in vivo の両方でいくつかの方法では、、であり、そしてお互いの欠点を補完少なくとも二つの方法は信頼性の高い洞察を得るために行われるべきである。
in vivoアッセイの場合は、二分子蛍光相補性（BiFC）アッセイは、生きた細胞内のタンパク質-タンパク質相互作用を検出するだけでなく、相互作用するタンパク質の1,2の細胞内局在を識別できる、最も人気があり、最も侵襲的なアプローチを表しています。このアッセイでは、非蛍光性のN -およびGFPまたはその変異体のC末端の半分がテストされたタンパク質に融合させ、そして2つの融合タンパク質が原因でテストタンパク質"相互作用するために一緒に持って来られる時、蛍光シグナルが3-6を再構成する。その信号は、落射蛍光または共焦点顕微鏡によって容易に検出可能であるため、BiFCは、生きた細胞3のタンパク質間相互作用について研究するための細胞生物学者の間で選択の強力なツールとして登場しました。このアッセイは、しかし、時には偽陽性の結果を生成することができます。例えば、蛍光シグナルは限りお互いから7 nmが小さいため細胞内コンパートメントに梱包閉じるには、むしろそのため、特定の相互作用7のように配置された2つのGFPフラグメントによって再構成することができる。
これらの制限のため、生細胞イメージング技術から得られた結果は、タンパク質相互作用を検出するための別の原理に基づいて、独立したアプローチによって確認されるべきである。共免疫沈降法（共同IP）またはグルタチオントランスフェラーゼ（GST）プルダウンアッセイ一般的にin vitroでのタンパク質-タンパク質相互作用を分析するために使用されているような代替方法を表しています。しかし、これらのアッセイIIN、しかし、テストしたタンパク質は、結合反応のためにsupportsusedバッファーに容易に溶解する必要があります。したがって、不溶性のタンパク質が関与する特異的な相互作用は、これらの手法によって評価することができます。
ここで、我々はこの困難を回避する有効な蛋白質の膜のオーバーレイ結合アッセイ、プロトコルを示しています。タンパク質の一つが細胞膜のマトリックス上に固定化されているため、この手法では、水溶性と不溶性のタンパク質間の相互作用を確実にテストすることができます。このメソッドは、そのようなBiFCなどのin vivo実験、 のとの組み合わせで、水溶性と不溶性のタンパク質の間で忠実に相互作用を調査し、特徴付けるために信頼性の高いアプローチを提供します。この記事では、ウイルスの細胞間輸送8-14、および最近同定された植物細胞の相互作用、タバコアンキリン反復を含むタンパク質（ANK中に複数の機能を発揮するタバコモザイクウイルス（TMV）移行タンパク質（MP）、の間の結合）15は 、このテクニックを使用して示されています。
Protocol
Discussion
このアプローチは、タンパク質の組み合わせの間のタンパク質-タンパク質相互作用をテストするのに適している、タンパク質の際に少なくとも一つは、結合バッファーに容易に可溶であり、成功したタンパク質17,18の他の組み合わせに適用した。これらの条件下で両方に不溶であるタンパク質の間iInteractionsは、このプロトコルでテストすることはできません。
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Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
当研究室での作業はNIH、食と農のUSDA国立研究所、NSF、BARD、DOE、及びBSFからVCへの補助金によってサポートされています
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 |
| Proteinase inhibitor cocktail | SIGMA | S8820 |
| Mini-PROTEAN system | Bio-RAD | 165-8000 |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-RAD | 170-3940 |
| Anti-rabbit IgG antibody conjugated with horse radish peroxidase | GenScript | A00098 |
| Anti-GST rabbit polyclonal antibody | GenScript | A00097 |
| Anti-strepII | GenScript | A00626 |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Scientific | 27377-000 |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | Millipore | WBKL S0 050 |
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