Protein Assay Overlay membrana: um protocolo para testar Interação entre proteínas solúveis e insolúveis In vitro</em
Summary
Interação proteína-proteína testes é indispensável para dissecção de funcionalidade da proteína. Aqui, nós apresentamos uma<em> In vitro</em> Ensaio de proteína-proteína de ligação à sonda uma membrana de proteína-imobilizada com uma proteína solúvel. Este ensaio fornece um método confiável para testar a interação entre uma proteína insolúvel e uma proteína em solução.
Abstract
Interações entre proteínas diferentes validar é vital para a investigação de suas funções biológicas em nível molecular. Existem vários métodos, tanto di vitro como in vivo, para avaliar a ligação às proteínas, e pelo menos dois métodos que complementam as deficiências do outro deve ser conduzido para obter conclusões confiáveis.
Para um ensaio di vivo, a complementação bimolecular de fluorescência ensaio (BiFC) representa a abordagem mais popular e menos invasivo que permite detectar a interação proteína-proteína dentro das células vivas, bem como identificar a localização intracelular de proteínas que interagem a 1,2. Neste ensaio, as metades não fluorescente N-e C-terminal da GFP, ou suas variantes são fundidos às proteínas testadas, e quando as duas proteínas de fusão são reunidos devido às interações das proteínas testadas ", o sinal fluorescente é reconstituído 06/03 . Porque seu sinal é facilmente detectável por microscopia de epifluorescência ou confocal, BiFC emergiu como uma poderosa ferramenta de escolha entre os biólogos para estudar sobre interações proteína-proteína em células vivas 3. Este ensaio, entretanto, às vezes pode produzir resultados falsos positivos. Por exemplo, o sinal fluorescente pode ser reconstituído por dois fragmentos de GFP dispostos, tanto quanto 7 nm um do outro devido a fechar embalagem, em um pequeno compartimento subcelular, e que, devido a interações específicas 7.
Devido a essas limitações, os resultados obtidos a partir de tecnologias de imagem ao vivo de células deve ser confirmado por uma abordagem independente, baseada em um princípio diferente para a detecção de interações proteína. Co-imunoprecipitação (IP-Co) ou glutationa transferase (GST) suspenso ensaios representam tais métodos alternativos que são comumente usados para analisar interações proteína-proteína in vitro. No entanto, estes ensaios iin, no entanto, as proteínas testado deve ser facilmente solúvel no buffer que supportsused para a reação de ligação. Portanto, interações específicas, envolvendo uma proteína insolúvel não podem ser avaliados por estas técnicas.
Aqui, nós ilustrar o protocolo para o ensaio overlay proteína de membrana de ligação, que contorna esta dificuldade. Nesta técnica, a interação entre as proteínas solúveis e insolúveis podem ser seguramente testado, porque uma das proteínas é imobilizado em uma matriz de membrana. Este método, em combinação com experimentos di vivo, tais como BiFC, fornece uma abordagem confiável para investigar e caracterizar as interações entre proteínas fielmente solúveis e insolúveis. Neste artigo, a ligação entre o vírus do mosaico do tabaco (TMV) proteína de movimento (MP), que exerce várias funções durante o transporte célula a célula-viral 8-14, e um interator planta recentemente identificado celulares, tabaco anquirina repetir proteína contendo (ANK ) 15, é demonstrado usando esta técnica.
Protocol
Discussion
Esta abordagem é adequada para testar interações proteína-proteína entre as combinações das proteínas, quando pelo menos um dos quais as proteínas é facilmente solúvel no buffer de ligação, e foi aplicado com sucesso em outra combinação de proteínas 17,18. O iInteractions entre as proteínas que são insolúveis nestas condições não pode ser testada por este protocolo.
Além disso, redobrando bem-sucedida de ProIM é fundamental para o ensaio. Lavar a membrana e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho em nosso laboratório é suportada por concessões do NIH, National Institute of USDA para Agricultura e Alimentação, NSF, BARD, DOE, e BSF para VC
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 |
| Proteinase inhibitor cocktail | SIGMA | S8820 |
| Mini-PROTEAN system | Bio-RAD | 165-8000 |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-RAD | 170-3940 |
| Anti-rabbit IgG antibody conjugated with horse radish peroxidase | GenScript | A00098 |
| Anti-GST rabbit polyclonal antibody | GenScript | A00097 |
| Anti-strepII | GenScript | A00626 |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Scientific | 27377-000 |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | Millipore | WBKL S0 050 |
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