Protein Membrane Overlay-analys: Ett protokoll till Test Interaktion mellan lösliga och olösliga proteiner In vitro</em
Summary
Testa protein-protein interaktion är nödvändig för dissekering av proteiner fungerar. Här presenterar vi ett<em> In vitro</em> Protein-proteinbindning analys för att undersöka ett membran-immobiliserade protein med ett lösligt protein. Denna analys ger en tillförlitlig metod för att testa samspelet mellan ett olösligt protein och ett protein i lösning.
Abstract
Validering av interaktioner mellan olika proteiner är avgörande för undersökning av deras biologiska funktioner på molekylär nivå. Det finns flera metoder, både in vitro och in vivo, för att utvärdera proteinbindning, och åtminstone två metoder som kompletterar bristerna i varandra bör genomföras för att få tillförlitliga insikter.
För en in vivo, representerar bimolecular fluorescens komplettering (BiFC assay) de mest populära och minst invasiva metoden som gör det möjligt att upptäcka protein-protein växelverkan i levande celler, samt identifiera de intracellulära lokaliseringen av de interagerande proteiner 1,2. I denna analys, är icke-fluorescerande N-och C-terminal halvor av GFP eller dess varianter smält att testas proteiner, och när de två fusionsproteiner förs samman på grund av de testade proteiner "interaktion är fluorescerande signal färdigberedda 3-6 . Eftersom dess signal är lätt upptäckas med epifluorescence eller konfokalmikroskopi har BiFC framträtt som ett kraftfullt verktyg att välja bland cell biologer för att studera om protein-protein interaktioner i levande celler 3. Denna analys kan dock ibland ge falskt positiva resultat. Till exempel kan den fluorescerande signalen beredas av två GFP fragment ordnas så långt som 7 nm från varandra på grund av nära packning i en liten subcellulära fack, utan att på grund av specifika interaktioner 7.
På grund av dessa begränsningar bör de resultat som erhållits från levande teknik cell imaging bekräftas av en oberoende strategi som bygger på en annan princip för att upptäcka proteininteraktioner. Co-immunoprecipitation (Co-IP) eller glutationtransferas (GST) pull-down-analyser representerar sådana alternativa metoder som allmänt används för att analysera protein-protein interaktioner in vitro. Men Beräkningsgrund för skatt dessa analyser måste dock de testade proteiner vara lättlöslig i den buffert som supportsused för bindande reaktion. Därför kan inga specifika interaktioner mellan ett olösligt protein inte bedömas av dessa tekniker.
Här visar vi protokollet för det protein membran overlay bindande analys, som kringgår denna svårighet. Med denna teknik kan interaktion mellan lösliga och olösliga proteiner på ett tillförlitligt sätt testas eftersom ett av de proteiner som är immobiliserade på ett membran matris. Denna metod i kombination med in vivo-experiment, som BiFC, ger en tillförlitlig metod för att undersöka och karakterisera interaktioner troget mellan lösliga och olösliga proteiner. I denna artikel bindande mellan tobak viruset (TMV) rörelse protein (MP), som utövar flera funktioner under virala cell till cell transporter 8-14, och ett nyligen identifierat anläggning cellulära Interactor, tobak ankyrin upprepa innehåller protein (ANK ) 15, påvisas med denna teknik.
Protocol
Discussion
Detta tillvägagångssätt är lämpligt för testning protein-protein interaktioner mellan kombinationer av proteiner, när minst en av dessa proteiner är lätt löses upp i bindande buffert och framgångsrikt tillämpats på annan kombination av proteiner 17,18. Den iInteractions mellan de proteiner som är både olösliga under dessa förhållanden kan inte testas av detta protokoll.
Dessutom lyckas vika av ProIM kritiska för analysen. Sköljning membranet i TBS efter electro…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet i vårt laboratorium stöds av anslag från NIH, USDA National Institute of livsmedel och jordbruk, NSF, Bard, DOE, och BSF till VC
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 |
| Proteinase inhibitor cocktail | SIGMA | S8820 |
| Mini-PROTEAN system | Bio-RAD | 165-8000 |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-RAD | 170-3940 |
| Anti-rabbit IgG antibody conjugated with horse radish peroxidase | GenScript | A00098 |
| Anti-GST rabbit polyclonal antibody | GenScript | A00097 |
| Anti-strepII | GenScript | A00626 |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Scientific | 27377-000 |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | Millipore | WBKL S0 050 |
Riferimenti
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9, 789-798 (2002).
- Citovsky, V. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. J Mol Biol. 362, 1120-1131 (2006).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Shyu, Y. J. Visualization of protein interactions in living Caenorhabditis elegans using bimolecular fluorescence complementation analysis. Nat Protoc. 3, 588-596 (2008).
- Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta. Methods. 45, 196-206 (2008).
- Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).
- Zamyatnin, A. A. Assessment of the integral membrane protein topology in living cells. Plant J. 46, 145-154 (2006).
- Citovsky, V., Knorr, D., Schuster, G., Zambryski, P. C. The P30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein. Cell. 60, 637-647 (1990).
- Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science. 270, 1983-1985 (1995).
- Tomenius, K., Clapham, D., Meshi, T. Localization by immunogold cytochemistry of the virus coded 30 K protein in plasmodesmata of leaves infected with tobacco mosaic virus. Virology. 160, 363-371 (1987).
- Ding, B. Secondary plasmodesmata are specific sites of localization of the tobacco mosaic virus movement protein in transgenic tobacco plants. Plant Cell. 4, 915-928 (1992).
- Meshi, T. Function of the 30 kd protein of tobacco mosaic virus: involvement in cell-to-cell movement and dispensability for replication. EMBO J. 6, 2557-2563 (1987).
- Wolf, S., Deom, C. M., Beachy, R. N., Lucas, W. J. Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit. Science. 246, 377-379 (1989).
- Waigmann, E., Lucas, W. J., Citovsky, V., Zambryski, P. C. Direct functional assay for tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein and identification of a domain involved in increasing plasmodesmal permeability. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 1433-1437 (1994).
- Ueki, S., Spektor, R., Natale, D. M., Citovsky, V. ANK, a host cytoplasmic receptor for the Tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein, facilitates intercellular transport through plasmodesmata. PLoS Pathog. 6, e1001201-e1001201 (2010).
- Coligan, J. E., Dunn, B. M., Ploegh, H. L., Speicher, D. W., Wingfield, P. T., Taylor, G. . , (2011).
- Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. VIP1, an Arabidopsis protein that interacts with Agrobacterium VirE2, is involved in VirE2 nuclear import and Agrobacterium infectivity. EMBO J. 20, 3596-3607 (2001).
- Chen, M. H., Sheng, J., Hind, G., Handa, A., Citovsky, V. Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement. EMBO J. 19, 913-920 (2000).
