Summary

El aislamiento de islotes humanos de pacientes parcialmente Pancreatectomized

Published: July 30, 2011
doi:

Summary

La oferta de la diabetes tipo 2 isletas para la investigación es insuficiente. Aquí compartimos nuestro protocolo para el aislamiento de islotes de pacientes sometidos a pancreatectomía parcial. Este enfoque representa un lugar único para la obtención de islotes de diabetes tipo 2 y clínicamente emparejado sujetos no diabéticos en un número suficiente de estudios básicos y clínicos.

Abstract

Las investigaciones sobre la patogénesis de la diabetes tipo 2 y los islotes de Langerhans un mal funcionamiento se han visto obstaculizadas por la limitada disponibilidad de islotes con diabetes tipo 2 de 2 donantes de órganos. Aquí compartimos nuestro protocolo para el aislamiento de islotes de tejido pancreático humano obtenido de diabetes tipo 2 y pacientes no diabéticos que han sido sometidos a pancreatectomía parcial debido a diferentes enfermedades pancreáticas (tumores benignos o malignos de páncreas, pancreatitis crónica, y el conducto biliar común o tumores duodenales) . Todos los pacientes involucrados dieron su consentimiento para este estudio, que también había sido aprobado por el comité de ética local. Los especímenes quirúrgicos fueron entregados inmediatamente al patólogo que seleccionaron suave y saludable del tejido pancreático que aparecen para el aislamiento de los islotes, conservando el tejido dañado con fines de diagnóstico. Hemos encontrado que aislar más de 1.000 islotes, que teníamos que empezar con al menos 2 g de tejido pancreático. También es esencial para nuestro protocolo fue visible para distender los tejidos cuando se inyectan los medios de comunicación que contienen enzimas y, posteriormente, pelos para facilitar la digestión, aumentando la superficie.

Para ampliar la aplicabilidad de nuestro protocolo para incluir los casos ocasionales en los que una gran cantidad (> 15 g) de tejido pancreático humano está disponible, se utilizó una cámara de Ricordi (50 ml) a digerir el tejido. Durante la digestión, que sacudió de forma manual de la cámara de Ricordi 3 con una intensidad que varía por el modelo de acuerdo a su nivel de fibrosis de los tejidos. Un gradiente de Ficoll discontinuo se utilizó para separar los islotes del tejido acinar. Hemos tomado nota de que el precipitado de tejido debe ser lo suficientemente pequeño como para ser homogénea resuspendieron en medio Ficoll con una densidad de 1,125 g / ml. Tras el aislamiento, que cultivan los islotes en condiciones de estrés (sin agitación o rotación) con 5% de CO 2 a 37 ° C durante al menos 48 h con el fin de facilitar su recuperación funcional. La aplicación generalizada de nuestro protocolo y sus mejoras en el futuro podría permitir la recolección oportuna de grandes cantidades de islotes humanos de la diabetes y la clínica con sujetos no diabéticos, en gran medida el avance de investigación de tipo 2 diabetes.

Protocol

1. La colección de tejidos del páncreas en la sala de operaciones El cirujano realiza una resección parcial del páncreas. Después de colocar la muestra de páncreas en una caja de hielo, de presentar inmediatamente al patólogo. 2. Selección del tejido para el aislamiento de islotes El patólogo selecciona tejido que parece suave y saludable, manteniendo el tejido dañado con fines de diagnóstico. Tejido fibrótico y las muestras que ofrecen menos de 2 g de tejido útil están excluidos de aislamiento de islotes. Sumergir el tejido pancreático en euros solución Collins y entregar en hielo al laboratorio. 3. Aislamiento de islotes humanos Pese el tejido pancreático, a continuación, colóquelo en un plato de 10 cm. Ponga 150 ml RPMI medios de comunicación en un frasco de 500 ml. En un matraz de 250 ml, prepare la solución de enzimas digestivas mediante la combinación de 130 ml RPMI medios de comunicación con 100 mg / ml y 20 ml DNasa de RI Liberase 5mg/ml. Draw 10 ml de esta solución en una jeringa para inyectar el tejido pancreático. Se inyecta la solución de enzimas digestivas en el tejido pancreático, con el objetivo de que se distienden homogénea. Si se trata de prevenir la fibrosis, la digestión es probable que no. A continuación, picar los tejidos en ~ 4 mm 3 piezas en el hielo. 4. Páncreas humano circuito de la digestión Montar el circuito de la digestión, como se muestra en la Figura 1. La dirección del flujo en la cámara de Ricordi se encuentra en la parte inferior y salida en la parte superior de la cámara. Añadir la solución de enzimas digestivas restante en el matraz de 500 ml hasta un volumen total de 300 ml e insertar un termómetro. Transferir el tejido pancreático en la cámara, inserte la malla (diámetro de poro: 600 m) y tres canicas de nitruro de silicio (diámetro: 15 mm), cerca de la cámara y encienda la bomba con el caudal fijado en 140 ml / min. Cuando la temperatura del circuito llega a 37 ° C, iniciar el cronometraje y periódicamente toman muestras para determinar el momento de detener la digestión. Tinción con ditizona (2 mg / ml) permite la visualización microscópica de los islotes dentro del tejido digerido 4. Una vez que los islotes están separados del tejido acinar alrededores, rápidamente detener la digestión mediante la colocación de la bobina de calentamiento sobre el hielo y añadir 200 ml de medio de lavado en frío (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM de glucosa y 10% de SFB) al circuito. Recoger la solución de los islotes en 250 ml tubos cónicos como sale del tubo de muestra. Continúe hasta que el circuito está vacío. Figura 1. El circuito de la digestión humana páncreas El páncreas circuito de la digestión humana incluye una cámara de Ricordi que contiene la malla (diámetro de poro: 600 m) y tres bolas de nitruro de silicio (diámetro: 15 mm). Salida de la cámara es impulsada en el matraz de recogida de tejidos por la bomba peristáltica (140 ml / min). Las flechas indican la dirección del flujo. Una temperatura óptima para la digestión enzimática se mantiene mediante la inmersión de la bobina de calentamiento en un baño de agua a 37 ° C. 5. Lavado después de la digestión Centrífuga de 250 ml tubos cónicos que contengan la solución de los islotes a 1.000 rpm, 4 º C durante 5 min. Descartar el sobrenadante, resuspender el precipitado de los islotes en los medios de comunicación de lavado (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM de glucosa y 10% de SFB) y distribuirlo en fracciones iguales a tubos de 50 ml cónicos. (Opcional:. Distribuir en tubos cónicos adicionales para mejorar el lavado) Se centrifuga a 1000 rpm, 4 º C durante 5 min. Desechar el sobrenadante y extraiga con cuidado pellets por agitación manual. 6. La purificación en un gradiente de Ficoll Resuspender el precipitado con Ficoll los medios de comunicación a una densidad de 1,125 g / ml, pH 7,4, y poco a poco superposición de alícuotas de 10 ml de Ficoll los medios de comunicación con una densidad de 1,080, 1,060 y 1,037 g / ml. Centrifugar los gradientes de Ficoll a 2400 rpm, 4 º C durante 20 min. 7. Colección islote y Cultura Después de la centrifugación, los diferentes componentes del tejido se pueden distinguir por su repartición en el degradado. Descartar la capa superior que consta de grasa y tejido conectivo. Con cuidado, la cosecha de la primera capa de áridos islote en la 1.037-1.060 g / ml interfase. Esta capa contiene los islotes aislados más puro. Recoger las fracciones por separado para el aislamiento eficiente. Recoger la fracción de segundo, menos puro de los agregados de los islotes en el 1.060-1.080 g / ml interfase. Diluir el gradiente de Ficoll mediante la adición de medio de lavado (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM de glucosa y 10% de SFB) a cada tubo cónico hasta un volumen total de 50 ml. Centrifugar a 1000 rpm, 4 º C durante 5 min. Eliminar el sobrenadante por aspiración. Tenga cuidado de que la pastilla esté suelto debido al gradiente de Ficoll. Lave el wi pelletsª lavar los medios de comunicación (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM de glucosa y 10% de SFB) y se centrifuga a 1000 rpm, 4 º C durante 5 min. Repita el uso de los medios de comunicación islote cultura Resuspender los islotes en los medios de cultivo y colocarlos en la incubadora con 5% de CO 2 a 37 ° C durante 24-48 horas antes de su posterior procesamiento.

Representative Results

Nuestro protocolo se obtuvo un promedio de ~ 500 islotes por gramo de tejido pancreático, aunque este muy variado entre los preparados debido en gran parte a diferencias en la fibrosis y la actividad de la colagenasa. Hemos conseguido> 90% de pureza islote mediante tinción primero con ditizona durante el procesamiento de tejidos, y luego eligiendo a dedo 24 horas después de su aislamiento. Para determinar la calidad de los islotes purificados, la prueba de 25 mM de glucosa estimulada por la secreción de insulina en condiciones estáticas durante 2 horas. Hemos encontrado la secreción de insulina comparable a la de islotes obtenidos de ECIT aislamiento de islotes y los centros de trasplante. Como islotes aislados de páncreas parcialmente pancreatectomized no son para el trasplante de islotes, la evaluación del IEQ total no se considera un factor crítico. Es importante destacar que nuestro método nos ha permitido aislar los islotes de los estudios funcionales de 25 pacientes parcial pancreatectomized entre 2005 y 2008 5. Estos islotes fueron analizados para la glucosa estimulada por la secreción de insulina y la expresión de proteínas por Western Blot e inmunohistoquímica. Islotes aislados de parte pancreatecomized páncreas también podría ser utilizado para comparar los genes y los perfiles de expresión de proteínas, el aspecto ultraestructural y las respuestas funcionales de los islotes no diabéticos y diabéticos. Debido a que hay mayor número de pacientes sometidos a pancreatectomía parcial que existen donantes de órganos, el protocolo podría permitir suficientes muestras y datos que se recojan para el análisis estadístico robusto.

Discussion

Utilizando el protocolo, los islotes se pueden aislar a partir de tejido pancreático recogidos de una pancreatectomía parcial. El éxito de este protocolo se basa en el cuidado durante un pocos puntos críticos. Para preservar la viabilidad de las células beta, es esencial que la muestra se transporta rápidamente en hielo al laboratorio. Además, la duración de la digestión de los tejidos deben ser optimizados empíricamente de acuerdo con el grado de fibrosis del tejido y la actividad enzimática de los medios de comunicación. Esto también es válido para el grado de fuerza mecánica aplicada manualmente a la cámara de Ricordi. Así, para obtener un rendimiento islote bien, el protocolo se realiza mejor por un científico dedicado o asistente técnico. El fracaso inicial de la norma es menos que el equipo ya tiene experiencia en el aislamiento de los islotes.

Hay diferencias fundamentales entre el protocolo de aislamiento de islotes y el método estándar de aislamiento de islotes humanos: 1) A pesar de que el uso de tejido pancreático sometido a varias horas de isquemia durante el procedimiento quirúrgico, éstos son procesados ​​inmediatamente en el sitio. Esto está en contraste con páncreas explantados de donantes con muerte cerebral para el trasplante de páncreas / islote, que siguen siendo isquémica por varias horas durante la asignación y entrega a la instalación de aislamiento de islotes. 2) Se inyecta colagenasa directamente en el tejido pancreático, mientras que el protocolo estándar para infundir en el conducto pancreático. 3) Se separan los islotes mediante un gradiente de Ficoll discontinuo en vez de recoger los islotes a partir de un gradiente de Ficoll continua usando un procesador celular COBE.

En los casos en que la pieza quirúrgica es demasiado fibroso o escasos para el aislamiento de un número suficiente de islotes, el tejido todavía pueden ser recuperados por microdisección de captura láser (LCM) 10. Esto permite que los datos de expresión genética para recuperarse de prácticamente todas las muestras, aunque el aislamiento de islotes falla o el rendimiento es muy bajo. Desafortunadamente, la LCM no produce las células vivas para estudios funcionales y su cantidad suele ser insuficiente para el análisis proteómico. Por lo tanto, con LCM en paralelo con nuestro protocolo de digestión con colagenasa para recuperar los islotes puede ser la forma más eficaz de procesar las muestras quirúrgicas.

En la recogida de tejidos para el aislamiento de los islotes de pancreatectomías parcial, es importante examinar cuidadosamente la historia clínica del paciente y su estado metabólico. Un paciente parcialmente pancreatectomized podrían verse afectados por diabetes tipo 3c, es decir, diabetes secundarias a la enfermedad del páncreas que conduce a la cirugía 6. De los 43 pacientes participantes que se sometieron a esta cirugía en nuestro departamento en el 2010, 32 eran no diabéticos, 5 fueron afectados por diabetes tipo 2 y 6 tenían diabetes tipo 3c. Estos datos concuerdan con estudios anteriores que señalaban que el metabolismo de la glucosa y diabetes en una fracción considerable de pacientes que sufren de cáncer de páncreas o pancreatitis crónica 6. Hemos considerado la diabetes de origen primario, si se le diagnosticó al menos un año antes de la aparición de los síntomas que conducen a la cirugía pancreática 7. Los niveles de anticuerpos contra los islotes autoantígenos también debe medirse para evaluar la posibilidad de un origen autoinmune de la diabetes 8. Debido a que un paciente sometido a pancreatectomía podría sufrir de diabetes no diagnosticada o ser intolerantes a la glucosa, los pacientes no diabéticos, se debe dar una prueba de sobrecarga oral de glucosa antes de la pancreatectomía 9.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Queremos agradecer a nuestros colegas de muchos de los que siempre ayuda, consejo y aporte fundamental en las distintas etapas del proyecto. La producción de este artículo contó con el apoyo de vídeo, con fondos del Ministerio Alemán de Educación e Investigación (BMBF) para el Centro Alemán de Investigación de la Diabetes (DZD, http://www.dzd-ev.de ), IMIDIA ( http://www . imidia.org ) y el Hospital Universitario Carl Gustav Carus en la Universidad de Tecnología de Dresde. La investigación que lleva a estos resultados ha recibido financiación del Programa de la Comunidad Europea Séptimo Programa Marco (FP7/2007-2013) para la Iniciativa de Medicamentos Innovadores en el acuerdo de subvención n ° 115005.

Materials

Name Company Catalogue number
Equipment
1 ml serological pipette (CELLSTAR) greiner bio-one 604181
10 ml serological pipette (CELLSTAR) greiner bio-one 607180
25 ml serological pipette (CELLSTAR) greiner bio-one 760180
10 ml Syringe BD (Becton, Dickinson and Company) 300912
50 ml Syringe BD (Becton, Dickinson and Company) 300865
5 ml Syringe BD (Becton, Dickinson and Company) 309050
18 G 1,1/2 Needle Microlance 3 BD (Becton, Dickinson and Company) 304622
27 Gx1/2 Needle Braun 4658300
27 Gx3/4 Needle Microlance 3 BD (Becton, Dickinson and Company) 302200
3 cm cell culture dish 2×2 mm grid Nunc 174926
20 cm Tissue culture dish BD (Becton, Dickinson and Company) 353003
6 cm Easy grip petri dish BD (Becton, Dickinson and Company) 351016
150 ml storage bottle Corning Incorporated 431175
250 ml Erlenmeyer flasks Schott Duran 21 217 36
500 ml Erlenmeyer flasks Schott Duran 21 217 44
250 ml Screw Cap Conical Bottom Centrifuge Tube Corning Incorporated 430776
50 ml Falcon conical tube BD (Becton, Dickinson and Company) 352070
260 ml Easyflask Non-treated Nunc 156800
Millex GV Filter Unit Duropore (0,22 μm) Millipore SLGV033RB
Bottle Top Vacuum Filter (PES 70 mm Diameter Membran, 0,22 μm pore size, 45 mm neck size, 500 mL volume) Corning Incorporated 431118
Densitometer (Densito 30PX) LWE37463 Mettler Toledo 51324450
Fast PES Filter Unit 0,2 μm Nalgene 569-0020
Heating Coil BioRep Technologies Inc HC-02
Multifuge 4 KS-R Heraeus 75015680
Pump Typ PD5206 Heidolph 523-52060-00-2
Ricordi chamber (metal mesh with 600 μm pore diameter) BioRep Technologies Inc. Model 50-U-01, Serial 0503-001
Preparation Stand BioRep Technologies Inc. 50-PS-01
O-Rings BioRep Technologies Inc. OR-50-U-01
Silicon Nitride Marbles (15 mm set of 9) BioRep Technologies Inc. SN-01
Silicon Tubing Tygon R 3603 8,0X4,0 mm
Surgical forceps Braun BD168R
Surgical scissors (Aesculap) Braun BC273R
Water bath OLS 200 Grant OLS 200
Reagents
Collagenase -> Liberase RI (100 mg) Roche 11815032001
D(+)-Glucose Merck 1.08337.1000
Dimethylsulfoxide (DMSO) Merck 1.16743.1000
Diphenylthiocarbazone (DTZ) Sigma Aldrich D5130
DNase I (100 mg) Roche 10104159001
Dulbeccos 1xPBS PAA Laboratories H15-002
Electrolytsolution E154 Serumwerk 00509
Fetal Bovine Serum (FBS) PAA Laboratories A15-101
Ficoll 400 Sigma Aldrich F9378
Foetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10270-106
2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfons‰ure (HEPES) Roth 9105.3
NaOH, 5 M clinical pharmacy, hospital
Penicillin/Streptomycin (100x) PAA Laboratories P11-010
Pipettaid (EXPRESS) BD (Becton, Dickinson and Company) 357591
Potassiumchlorid Fluka 60132
Potassiumdihydrogenphospate anhydrous JT Baker 0241
Potassiummonohydrogenphosphate JT Baker 3246-01
RPMI Medium 1640 [-]D-Glucose [+]L-Glutamine Gibco 11879-020
RPMI Medium 1640 [+]L-Glutamine PAA Laboratories E15-840
Sodiumhydrogencarbonat Merck 1.06329.0500

Media and Solutions

Dithizone Solution

  • Dissolve 100 mg DTZ in 10 ml DMSO and dilute in 40 ml PBS
  • Sterile filter the solution (0.22 μm)

Enzyme Solution

  • Dissolve 100 mg Liberase RI in 20 ml RPMI 1640 media (without supplements)
  • Dissolve 100 mg DNase in 1 ml RPMI 1640 media (without supplements)
  • Sterile filter the solution (0.22 μm) and keep the enzyme on ice

Wash media (1000ml/5.5mM Glucose)

  • Dissolve 100 ml FBS (heat inactivated)
  • Add 450 ml RPMI 1640 (no glucose)
  • Add 450 ml RPMI 1640 (11 mM glucose)
  • Sterile filter the solution (0.22 μm)

Islet culture media (500ml/5,5mM Glucose)

  • Dissolve 10 ml 1M HEPES (pH 7.4)
  • Add 50 ml FBS
  • Add 5 ml penicillin/streptomycin (100x)
  • Add 2.75 ml 1 M Glucose Solution
  • Add 432.25 ml RPMI 1640 (no glucose)
  • Sterile filter the solution (0.22 μm)

Euro Collins Solution

  • 4,083 g potassium hydrogenphosphate
  • 70,0 g glucose
  • 2,237 g potassium chloride
  • 14,80 g potassium monohydrogenphosphate
  • 1,680 g sodium hydrogencarbonate
  • 40 ml electrolyte solution (E 154)
  • pH 7.4
  • Add distilled water up to 2000 ml
  • Sterile filter the solution (0.22 μm)

Ficoll Stock Solution

  • Add 1000 ml of Euro Collins Solution to 500 g Ficoll
  • Add 8.94 g HEPES
  • Stir overnight until Ficoll is solved
  • pH 7.4
  • Measure the density

Ficoll Gradients

  • Calculate the amount of FBS, Euro Collins Solution and Ficoll Stock Solution according to the density
  • Combine the 3 solutions and measure the density with a densitometer
  • Add Euro Collins Solution or Ficoll Stock Solution until the density is adjusted
  • Sterile filter the solution (0.22 μm) and store at 4°C

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Bötticher, G., Sturm, D., Ehehalt, F., Knoch, K. P., Kersting, S., Grützmann, R., Baretton, G. B., Solimena, M., Saeger, H. D. Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients. J. Vis. Exp. (53), e2962, doi:10.3791/2962 (2011).

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