लक्ष्य निर्धारण घ्राण बल्ब संयुक्त का प्रयोग न्यूरॉन्स Vivo में Electroporation और Gal4 आधार बढ़ाने जाल Zebrafish लाइन्स
Summary
आनुवंशिक जोड़तोड़ के अस्थायी और स्थानिक संकल्प जैविक घटना है कि वे उपद्रव कर सकते हैं की स्पेक्ट्रम निर्धारित करता है. यहाँ हम अस्थायी और spatially असतत उपयोग<em> Vivo में</em> Electroporation, zebrafish के ट्रांसजेनिक लाइनों के साथ संयुक्त, विशेष रूप से विकासशील घ्राण बल्ब के न्यूरॉन्स में एक GFP transgene की अभिव्यक्ति को प्रेरित.
Abstract
In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.
Protocol
Discussion
यहाँ हम zebrafish कि बढ़ाने जाल Gal4 ट्रांसजेनिक लाइन विकासशील घ्राण बल्ब में कक्षों की विशिष्ट जनसंख्या को electroporated transgene की अभिव्यक्ति लक्ष्य इस्तेमाल में vivo electroporation विधि में वर्णित है. इस दृष्टिकोण 7 electroporation vivo में सेल प्रकार विशिष्ट बढ़ाने जाल ट्रांसजेनिक 8 लाइनों द्वारा मध्यस्थता अभिव्यक्ति के साथ उत्कृष्ट के अस्थायी समाधान को जोड़ती है. यहाँ हालांकि हम घ्राण बल्ब के लक्ष्यीकरण का वर्णन किया है, vivo electroporation में विकासशील तंत्रिका प्रणाली 2-7 के अन्य क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और बढ़ाने जाल लाइनों Gal4 के कई अलग अलग विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं या ऊतकों में लक्षित अभिव्यक्ति के साथ उपलब्ध हैं 8, 11. बेशक, इस electroporation तकनीक भी LexA या Tet प्रणालियों 13, 14, 15 जैसे अन्य combinatioral आनुवंशिक दृष्टिकोण के लिए उपयुक्त होना चाहिए . Electroporation की एक प्रमुख लाभ यह है कि वहाँ अतिरिक्त ट्रांसजेनिक दिया है कि एक उपयुक्त Gal4 लाइन उपलब्ध है लाइनों बनाने की जरूरत नहीं है. यह छह महीने बचाता है.
Vivo electroporation में न्यूरॉन्स और उनके पूर्ववर्ती जो कुछ नर्वस सिस्टम के विकास के विशिष्ट चरण 7 ब्याज की है में oligonucleotides के समावेश के लिए अनुमति देता है . यह अस्थायी समाधान विशेष रूप से नुकसान के समारोह के विश्लेषण के लिए फायदेमंद है क्योंकि यह जीन है कि पहले विकास के चरणों में आवश्यक कार्य किया है लक्ष्यीकरण के साथ समस्याओं को दरकिनार कर सकते हैं. विधि हम यहाँ का वर्णन भी आरएनएआई oligonucleotides या constructs और morpholino विरोधी भावना 4 oligonucleotides, 7 सहित हानि के समारोह अभिकर्मकों को शामिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जैसे प्रमुख नकारात्मक प्रोटीन अभिव्यक्ति plasmids या छोटी सड़क के ढालवाँ आरएनएआई plasmids प्लाज्मिड संचालित अभिकर्मकों भी एक Gal4 यूएएस के नियंत्रण के अधीन रखा जा सकता है, सटीक सेल प्रकार के विशिष्ट अभिव्यक्ति हम यहाँ GFP की अभिव्यक्ति के लिए दिखाया गया है के लिए अनुमति देता है.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एक NIH R15 क्षेत्र अनुदान के माध्यम से जॉन हॉर्न (; R15MH083221 NIMH) के लिए वित्त पोषित किया गया था.
Materials
Reagents:
- Agarose, low-melting-point (Sigma, A9414)
- Plasmid midi- or maxi-prep kit (e.g. Qiagen, #12643]
- Phenol red (Sigma, P3532)
Equipment:
- Capillary glass with filament; ID = 0.78 mm; OD = 1.0 mm (Sutter Instruments, #BF100-78-10)
- Grass SD-9 Stimulator (Grass Technology, Model SD-9)
- Grass platinum subdermal electrodes, straight needle (Grass Technology, #E2)
- Micro-loader pipette tips (Eppendorf, #X22703R)
- Pipette puller (e.g. Sutter, Model P-30)
- Pipette puller (e.g. Sutter, Model P-30)
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