Nós apresentamos um protocolo para análise estrutural e de composição do biofilme oral natural de aparelhos ortodônticos com<em> In situ</em> Hybridization (FISH) e microscopia de varredura confocal a laser (CLSM). Amostras de biofilme oral foram coletados de expansores palatinos, raspagem de resina acrílica flocos de fora de sua superfície e encaminhá-los para o processamento molecular.
Microscopia de varredura confocal a laser (CLSM) do biofilme heterogênea natural é hoje facilitado por uma vasta gama de técnicas de coloração, sendo um deles hibridização fluorescente di situ (FISH). 1,2 Realizamos um estudo piloto em que as amostras coletadas de biofilme oral fixa aparelhos ortodônticos (palatal expansores) foram corados por FISH, com o objectivo de avaliar a organização tridimensional de biofilme naturais e acúmulo de placa. 3,4 FISH cria uma oportunidade para corar as células em seu ambiente nativo do biofilme com o uso de 16S fluorescente etiquetado rRNA de metas de sondas. 4-7,19 Em comparação com técnicas alternativas como a rotulagem de imunofluorescência, este é um barato, a técnica de rotulagem rigorosa e direto para investigar diferentes grupos de bactérias em biofilme consórcios mistos. 18,20 sondas foram usadas Geral que se ligam a Eubacteria ( EUB338 + + EUB338II EUB338III; seguir EUBmix), 8-10 Firmicutes (LGC354 AC;. LGCmix seguir), 9,10 e Bacteroidetes (Bac303) 11 Além disso, as sondas de ligação específico para Streptococcus mutans (MUT590) 12,13 e Porphyromonas gingivalis (IGP) foram usados 13,14 . A extrema dureza dos materiais de superfície envolvidos (aço inoxidável e resina acrílica) obrigaram-nos a encontrar novas maneiras de preparar o biofilme. Como estes materiais de superfície não poderia ser facilmente cortado com uma cryotome, vários métodos de amostragem foram exploradas para obter biofilme oral intacta. O mais viável dessas abordagens é apresentada na presente comunicação. Pequenos flocos da resina biofilme de transporte de acrílico foram raspados com um bisturi estéril, tomando cuidado para não danificar a estrutura do biofilme. Fórceps foram usados para coletar biofilme das superfícies de aço. Uma vez coletadas, as amostras foram fixadas e colocado diretamente sobre lâminas de vidro revestidas polysine. FISH foi realizada diretamente sobre esses slides com as sondas mentioned acima. FISH vários protocolos foram combinados e modificados para criar um novo protocolo que foi fácil de manusear. 5,10,14,15 Posteriormente as amostras foram analisadas por microscopia confocal de varredura a laser. Bem conhecidos 3,4,16,17 configurações podem ser visualizados, inclusive cogumelo estilo de formações e aglomerados de bactérias cocóide permeado por canais. Além disso, a composição bacteriana do biofilme típico dessas estruturas foram analisados e imagens 2D e 3D criado.
O protocolo descrito aqui é uma abordagem altamente viável para biofilmes coloração coletados de materiais duros. Amostragem e hibridação são as etapas mais críticas. Durante a amostragem, os cuidados devem ser tomados para que as fatias de espessura adequada são coletados para garantir que a estrutura do biofilme permanece intacta. Durante a hibridização, é essencial para evitar flutuações excessivas de temperatura, evitando ligação não específica, ou perda de ligação, das sondas fluorescente etiquetado. Este protocolo FISH é um método elegante para a mancha biofilme heterogêneos normal diretamente em lâminas de vidro, sem interromper sua composição. Os slides podem ser imediatamente utilizado para microscopia sem precisar mover a amostra, mais uma vez. Desta forma, uma melhoria em relação a coloração em tubos é obtido pela força de cisalhamento menor sendo aplicada ao biofilme. Fatias de> 50 mm de espessura podem ser preparados e investigados dessa forma.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelo Fonds de Higiene da Universidade Médica de Graz. Todos os atletas deram o seu consentimento informado. Aprovação institucional do protocolo do estudo foi obtido a partir da Universidade Médica de Graz.
Oligonucleotides | Target organism | Fluorochrome |
---|---|---|
EUB338 – 338III | Eubacteria | Cy3 |
LGC354 A-C | Firmicutes | FITC |
Bac303 | Bacteroidetes | Cy5 |
Mut590 | Streptococcus mutans | FITC |
POGI | Porphyromonas gingivalis | FITC |
Table 3. Oligonucleotides (refer to probeBase13 for details).
Component | Company | Comments |
---|---|---|
4% paraformaldehyde | 4% solution in PBS | |
1 x PBS | 3 x solution prepared | |
ddH2O | Millipore | |
Ethanol (100%) | Merck | |
Lysozyme | Roth | 100 mg/ml stock solution |
Formamide | Roth | 99.5% solution |
5 M NaCl | Roth | |
1 M Tris-HCl | Roth | |
2% SDS | Roth | |
FISH probes (oligonucleotides) | Invitrogen, Sigma | |
ProLong Gold antifadent | Invitrogen | |
Nail polish | ||
Equipment | ||
Incubator | Thermo Scientific | |
Water bath | IKA Tez | |
50 ml tubes | Sarstedt | |
Polysine-coated slides | Thermo Scientific |
Table 4. Materials and equipment.