肌醇pyrophosphates发挥重要作用,在人类病症如癌症,糖尿病和肥胖,但行动的确切机制是一个有争议的问题。缺乏市售肌醇pyrophosphates呈现详细的研究问题。在这里,我们描述了一个简单的协议,生产和隔离毫克肌醇pyrophosphates。
肌醇是目前在任未修改的性质,或在更复杂的磷酸衍生物。最新的,在真核细胞中最丰富的两个pentakisphosphate肌醇(IP 5)和肌醇hexakisphosphate(植酸或IP 6)。知识产权5和IP 6都包含一个或多个焦债券1肌醇焦磷酸分子的前体。磷酸化生成的IP 6 diphoshoinositolpentakisphosphate(IP 7或PP – IP 5)和bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate(IP 8或(PP)2 – 4的IP)。到目前为止,研究所有真核有机体肌醇pyrophosphates已被隔离。此外,负责肌醇焦磷酸合成酶的两个不同的类高度保守的整个进化2-4。
转换的IP 6激酶(知识产权6 KS)具有催化了巨大的灵活性, 知识产权 5 和 6的IP,以PP – IP 4 和 IP 7,随后,通过这些产品为底物,促进更复杂的分子的生成5,6 。近日,焦磷酸酶的第 二类是确定形式的酵母蛋白VIP 1(也称为PP – IP为5 K),它能够转换成IP 6 7到IP和IP 8 7,8 。
肌醇pyrophosphates规范许多不同的细胞过程,如胰岛素的分泌,端粒长度10,11,趋化12,水泡贩运13,磷酸盐动态平衡14和HIV – 1 GAG释放15。两个行动的机制已经被提出了这一类的分子。他们可以通过allosterically与特定的蛋白质,如AKT 的 16相互作用的细胞功能的影响。此外,焦集团捐赠磷酸盐预磷酸化蛋白17。这一研究领域的巨大潜力是阻碍的肌醇pyrophosphates,这是防止许多科学家研究这些分子和这个新的翻译后修饰的商业来源的情况下。目前可用的方法,来隔离肌醇pyrophosphates需要先进的色谱仪器 18,19 。这些程序使用酸性条件下,可能会导致20肌醇焦磷酸降解,从而恢复不好。此外,繁琐的柱后脱盐程序,限制其使用专门的实验室。
在这项研究中,我们描述了一个IP 6激酶和PP – IP 5激酶反应的产品的产生,隔离和净化要求不高的方法。这种方法是可能的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的能力,以解决高度磷酸肌醇磷酸盐20。以下的IP 6 K1和PP – IP 为5 K为底物酶促反应的IP 6,页面用于分离,随后在水洗脱产生肌醇pyrophosphates。
在生物化学肌醇焦的使用受到严格限制商业得不到这种化合物与现有的检测方法的敏感性差。的页面,从而使拥有不同数量的磷酸基团,和甲苯胺蓝( 图1),异结合磷酸基团的染料,分子分离的结合,使肌醇pyrophoshate开放研究的新途径20亚型容易检测。
页面技术的使用,净化肌醇焦磷酸酶反应产品进行outby无论是知识产权的6 K1或VIP1是一个简单,经济和可靠的方法,可以生产大量高质量的 IP 7。上面介绍的方法是不局限于简单的纯化的IP 7,但稍作修改所描述的协议可能允许不同范围的肌醇pyrophosphates净化。高等磷酸肌醇焦亚型,含有超过8个磷酸基团,可以检测到20,6作为基材使用的 IP或不同数量的 IP 6。这些肌醇pyrophosphates可以检测增加的染色过程中的长度,随后纯化(3.2节)。此外,5知识产权作为酶反应的底物的使用, 将使 PP – IP 5净化和其他含有肌醇肌醇环上的羟基pyrophosphates。
总之,这个要求不高的方法允许可靠的净化毫克量的肌醇pyrophosphates广泛使用的仪器,从而揭开了这一激动人心的研究领域的新途径。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢有益的意见A.列奇和念稿子。这项工作是支持的医学研究理事会(MRC)的拨款,细胞生物学组和一个人类前沿科学计划资助(RGP0048/2009-C)。
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Phytic Acid (IP6) | Sigma-Aldrich | P8810 |
Poly-P (sodium hexametaphosphate) | Sigma-Aldrich | P8510 |
ATP-Mg2+ salt | Sigma-Aldrich | A9187 |
OrangeG | Sigma-Aldrich | O3756 |
PhosphoCreatine (PCr) | Sigma-Aldrich | P7936 |
CreatinePhospho Kinase (CPK) | Sigma-Aldrich | C3755 |
GST-Vip1 | 17 | 17 |
His-IP6K1 | 18 | 18 |
His-Ddp1 | Available in lab | Available in lab |
Acrylamide:Bis-Acrylamide 19:1 (40%) | Flowgen | H16972 |
Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A9164 |
Tris/Borate/EDTA (TBE) | Sigma-Aldrich | T 9060 |
Temed | BDH | 43083G |
Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 198161 |
SpeedVac | Christ | 100218 |
Gel apparatus | Hoefer | SE600 |
Vacuum manifold | Christ | Alpha 2-4 |
Vacuum pump | ABM Greiffenberger | 4EKF63CX |