Inositol pyrofosfaten spelen een belangrijke rol in de menselijke ziekten zoals kanker, diabetes en obesitas, maar het exacte werkingsmechanisme is een kwestie van geschil. Het gebrek aan commercieel beschikbare inositol pyrofosfaten maakt gedetailleerde studies problematisch. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor het produceren en isoleren milligram inositol pyro.
Myo-inositol is aanwezig in de natuur of ongewijzigde of in meer complexe gefosforyleerde derivaten. Van de nieuwste, de twee meest voorkomende in eukaryote cellen zijn inositol pentakisphosphate (IP 5) en inositol hexakisphosphate (fytinezuur of IP-6). IP en IP 5 6 zijn de voorlopers van inositol pyrofosfaat moleculen die een of meer pyrofosfaat obligaties 1 bevatten. Fosforylatie van IP 6 genereert diphoshoinositolpentakisphosphate (IP-7 of PP-IP 5) en bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP 8 of (PP) 2-IP 4). Inositol pyrofosfaten zijn geïsoleerd van alle eukaryote organismen tot nu toe bestudeerd. Daarnaast zijn de twee verschillende klassen van enzymen die verantwoordelijk zijn voor de inositol pyrofosfaat synthese sterk geconserveerd doorheen de evolutie 2-4.
Het IP-6 kinases (IP 6 KS) bezitten een enorme katalytische flexibiliteit, het omzetten van IP en IP 5 6 tot en met PP-IP en IP-4 7 respectievelijk vervolgens door het gebruik van deze producten als substraten, bevordering van het genereren van meer complexe moleculen 5,6 . Onlangs werd een tweede klasse van pyrofosfaat het genereren van enzymen die in de vorm van de gist-eiwit VIP-1 (ook wel aangeduid als PP-IP 5 K), die in staat is om IP-6 om te zetten in IP-7 en 8 IP 7,8.
Inositol pyrofosfaten reguleren veel ongelijksoortige cellulaire processen zoals insuline secretie 9, de lengte van telomeren 10,11, chemotaxis 12, vesiculair transport 13, fosfaat homeostase 14 en HIV-1 gag los 15. Twee mechanismen van acties die zijn voorgesteld voor deze klasse van moleculen. Ze kunnen invloed hebben op cellulaire functie door allosterically interactie met specifieke eiwitten, zoals AKT 16. Als alternatief kan de pyrofosfaat groep kan een fosfaat doneren aan pre-gefosforyleerde eiwitten 17. Het enorme potentieel van dit onderzoek gebied wordt bemoeilijkt door het ontbreken van een commerciële bron van inositol pyrofosfaten, dat veel wetenschappers is het voorkomen van het bestuderen van deze moleculen en deze nieuwe post-translationele modificatie. De methoden die momenteel beschikbaar zijn inositol pyrofosfaten isoleren vereisen geavanceerde chromatografische apparatuur 18,19. Deze procedures gebruik van zure omstandigheden die kunnen leiden tot inositol pyrofosfaat degradatie 20 en dus tot een slechte herstel. Bovendien is de omslachtige post-column ontzouten procedures beperken het gebruik ervan aan gespecialiseerde laboratoria.
In deze studie beschrijven we een weinig veeleisende methode voor het opwekken, isolatie en zuivering van de producten van de IP 6-kinase en PP-IP 5-kinases reacties. Deze methode was mogelijk door het vermogen van polyacrylamide gel elektroforese (PAGE) op te lossen zeer gefosforyleerd inositol polyfosfaten 20. Volgende IP-6 K1 en PP-IP 5 K enzymatische reacties met behulp van IP-6 als de ondergrond, werd PAGE gebruikt om de gegenereerde inositol pyrofosfaten die vervolgens werden geëlueerd in water te scheiden.
Het gebruik van inositol pyrofosfaat in de biochemie wordt ernstig beperkt door de commerciële onbeschikbaarheid van dergelijke verbindingen en de slechte gevoeligheid van de bestaande detectiemethoden. De combinatie van pagina, die de scheiding van moleculen bezitten een verschillend aantal fosfaatgroepen, en Toluidine Blue (figuur 1), een metachromatische kleurstof die bindt aan fosfaat-groepen, maakt maakt het eenvoudig opsporen van inositol pyrophoshate isovormen het openen van nieuwe wegen van onderzoek 20.
De beschreven gebruik van de PAGE-technologie om inositol pyrofosfaat producten van de enzymatische reactie te zuiveren uitgevoerd outby ofwel IP-6 K1 of VIP1 is een eenvoudige, economische en betrouwbare methode die het mogelijk maakt voor de productie van grote hoeveelheden van hoge kwaliteit IP-7. De hierboven beschreven methode is niet beperkt tot de eenvoudige zuivering van IP-7, maar kleine wijzigingen van de beschreven protocol kan de zuivering van een andere reeks van inositol pyro mogelijk te maken. Hogere gefosforyleerd inositol pyrofosfaat isovormen, met meer dan acht fosfaat groepen kunnen worden gedetecteerd met behulp van IP-7 of verschillende hoeveelheden van IP-6 als een substraat 20,6. Deze inositol pyrofosfaten kan worden gedetecteerd door het verhogen van de lengte van de kleuring procedure en vervolgens gezuiverd (paragraaf 3.2). Bovendien zou het gebruik van IP-5 als substraat voor de enzymatische reactie kan de zuivering van PP-IP 5 en andere inositol pyrofosfaten met een hydroxylgroep op de inositol ring.
Kortom, deze niet veeleisend methode maakt het mogelijk om een betrouwbare zuivering van milligram hoeveelheden van inositol pyro met wijd beschikbare instrumenten, waardoor het openen van nieuwe wegen voor dit spannende onderzoeksveld.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken A. Riccio voor nuttige opmerkingen en om het manuscript te lezen. Dit werk werd ondersteund door de Medical Research Council (MRC) financiering van de Cell Biology Unit en door een Human Frontier Science Program Grant (RGP0048/2009-C).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Phytic Acid (IP6) | Sigma-Aldrich | P8810 |
Poly-P (sodium hexametaphosphate) | Sigma-Aldrich | P8510 |
ATP-Mg2+ salt | Sigma-Aldrich | A9187 |
OrangeG | Sigma-Aldrich | O3756 |
PhosphoCreatine (PCr) | Sigma-Aldrich | P7936 |
CreatinePhospho Kinase (CPK) | Sigma-Aldrich | C3755 |
GST-Vip1 | 17 | 17 |
His-IP6K1 | 18 | 18 |
His-Ddp1 | Available in lab | Available in lab |
Acrylamide:Bis-Acrylamide 19:1 (40%) | Flowgen | H16972 |
Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A9164 |
Tris/Borate/EDTA (TBE) | Sigma-Aldrich | T 9060 |
Temed | BDH | 43083G |
Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 198161 |
SpeedVac | Christ | 100218 |
Gel apparatus | Hoefer | SE600 |
Vacuum manifold | Christ | Alpha 2-4 |
Vacuum pump | ABM Greiffenberger | 4EKF63CX |