Pirofosfatos inositol juegan un papel importante en patologías humanas del cáncer, la diabetes y la obesidad, sin embargo, el mecanismo exacto de acción es un asunto de disputa. La falta de pirofosfatos inositol disponibles en el mercado hace que los estudios detallados problemática. A continuación se describe un protocolo sencillo para producir y aislar miligramos de pirofosfatos de inositol.
Myo-inositol está presente en la naturaleza ya sea modificado o en derivados más complejos fosforilada. De los últimos, los más abundantes en las células eucariotas son dos pentaquifosfato inositol (IP 5) y hexakisfosfato inositol (ácido fítico o IP 6). IP 5 y 6 de IP son los precursores de las moléculas de pirofosfato de inositol que contienen uno o más bonos de un pirofosfato. La fosforilación de 6 de IP genera diphoshoinositolpentakisphosphate (IP 7 o 5 PP-PI) y bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP 8 o (PP) 2-IP 4). Pirofosfatos inositol se han aislado de todos los organismos eucariotas estudiados hasta ahora. Además, las dos clases distintas de las enzimas responsables de la síntesis de pirofosfato inositol son altamente conservado durante la evolución 2-4.
El 6 de IP quinasas (IP 6 Ks) posee una flexibilidad enorme catalizador, la conversión de IP 5 y 6 de IP a IP PP-4 y 7, respectivamente, IP y, posteriormente, mediante el uso de estos productos como sustratos, promover la generación de moléculas más complejas 5,6 . Recientemente, una segunda clase de enzimas generadoras de pirofosfato fue identificado en la forma de la proteína de levadura VIP 1 (también conocido como PP-IP 5 K), que es capaz de convertir 6 de IP a IP e IP 7 8 7,8.
Pirofosfatos inositol regulan muchos procesos celulares diferentes, tales como la secreción de insulina 9, 10,11 longitud de los telómeros, la quimiotaxis 12, el tráfico vesicular 13, 14 y homeostasis del VIH-1 gag versión 15. Dos mecanismos de acción han sido propuestos para esta clase de moléculas. Pueden afectar a la función celular por alostéricamente interactuar con proteínas específicas como AKT 16. Por otra parte, el grupo pirofosfato puede donar un grupo fosfato a la pre-fosforilados proteínas 17. El enorme potencial de este campo de investigación se ve obstaculizada por la ausencia de una fuente comercial de pirofosfatos de inositol, que está impidiendo que muchos científicos del estudio de estas moléculas y esta nueva modificación después de la traducción. Los métodos actualmente disponibles para aislar pirofosfatos inositol requieren sofisticados aparatos de cromatografía 18,19. Estos procedimientos utilizan condiciones ácidas que pueden conducir a la degradación del pirofosfato de inositol 20 y por lo tanto a una mala recuperación. Además, el engorroso columna post-procedimientos de desalinización restringir su uso a laboratorios especializados.
En este estudio se describe un método poco exigente para la generación, el aislamiento y la purificación de los productos de las 6 de IP-cinasa y PP-IP reacciones 5-quinasas. Este método fue posible gracias a la capacidad de la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) para resolver los polifosfatos inositol altamente fosforilada 20. Después de 6 de IP K1 y PP-IP 5 K reacciones enzimáticas con 6 de IP como el sustrato, PAGE se utiliza para separar los pirofosfatos genera inositol que se eluyen posteriormente en el agua.
El uso de pirofosfato de inositol en la bioquímica está severamente limitada por la falta de disponibilidad comercial de estos compuestos y la escasa sensibilidad de los métodos de detección existentes. La combinación de la página, que permite la separación de las moléculas que poseen distinto número de grupos fosfato, y el azul de toluidina (Figura 1), un colorante metacromática que se une a los grupos de fosfatos, permite la fácil detección de las isoformas de pyrophoshate inositol apertura de nuevas vías de investigación 20.
El uso de la tecnología descrita PAGE para purificar productos inositol pirofosfato de la reacción enzimática llevado outby ya sea IP 6 K1 o VIP1 es un método sencillo, económico y fiable que permite la producción de grandes cantidades de IP de alta calidad 7. El método descrito anteriormente no se limita a la simple purificación de IP 7, pero pequeñas modificaciones del protocolo descrito podría permitir la purificación de un rango diferente de pirofosfatos de inositol. Isoformas inositol fosforilado mayor pirofosfato, que contiene más de ocho grupos de fosfato pueden ser detectados utilizando IP 7 o diferentes cantidades de 6 de IP como un sustrato de 20,6. Estos pirofosfatos inositol puede ser detectado por el aumento de la duración del procedimiento de tinción y posteriormente purificado (sección 3.2). Por otra parte, el uso de IP 5 como sustrato para la reacción enzimática que permite la purificación del PP-5 de IP y otros pirofosfatos inositol que contiene un grupo hidroxilo en el anillo de inositol.
En conclusión, este método permite que poco exigente para la purificación confiable de cantidades de miligramos de pirofosfatos inositol con instrumentos ampliamente disponible, lo que abre nuevas vías para este campo de investigación apasionante.
The authors have nothing to disclose.
Damos las gracias a A. Riccio por sus valiosos comentarios y de leer el manuscrito. Este trabajo fue financiado por el Medical Research Council (MRC) de financiamiento a la Unidad de Biología Celular y por un ser humano Frontier Science Programa de Subvenciones (RGP0048/2009-C).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Phytic Acid (IP6) | Sigma-Aldrich | P8810 |
Poly-P (sodium hexametaphosphate) | Sigma-Aldrich | P8510 |
ATP-Mg2+ salt | Sigma-Aldrich | A9187 |
OrangeG | Sigma-Aldrich | O3756 |
PhosphoCreatine (PCr) | Sigma-Aldrich | P7936 |
CreatinePhospho Kinase (CPK) | Sigma-Aldrich | C3755 |
GST-Vip1 | 17 | 17 |
His-IP6K1 | 18 | 18 |
His-Ddp1 | Available in lab | Available in lab |
Acrylamide:Bis-Acrylamide 19:1 (40%) | Flowgen | H16972 |
Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A9164 |
Tris/Borate/EDTA (TBE) | Sigma-Aldrich | T 9060 |
Temed | BDH | 43083G |
Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 198161 |
SpeedVac | Christ | 100218 |
Gel apparatus | Hoefer | SE600 |
Vacuum manifold | Christ | Alpha 2-4 |
Vacuum pump | ABM Greiffenberger | 4EKF63CX |