Deze paper toont voor de isolering, zuivering en detectie van exosomes, evenals technieken voor de analyse van hun moleculaire inhoud. Deze methoden zijn aanpasbaar voor exosome isolatie van zowel de media voor celkweek en biologische vloeistoffen, en kan daarna analyse van moleculaire content ook nuttig zijn in functionele studies.
Het gebied van exosome onderzoek in volle ontwikkeling, met een dramatische toename in publicaties in de afgelopen jaren. Deze kleine blaasjes (30-100 nm) van endocytische oorsprong werden voor het eerst voorgesteld om te functioneren als een manier voor reticulocyten aan het transferrine-receptor uit te roeien, terwijl rijpen in de erytrocyten een, en werden later de naam exosomes. Exosomes worden gevormd door innerlijke knopvorming van een te late endosomen, het produceren van multivesiculaire organen (MVBs), en zijn vrij in het milieu door fusie van de MVBs met de plasmamembraan 2. Sinds de eerste ontdekking van exosomes, hebben een breed bereik van cellen is aangetoond dat deze blaasjes vrij te geven. Exosomes zijn ook aangetroffen in diverse biologische vloeistoffen, waaronder plasma, nasale lavage vocht, speeksel en moedermelk 3-6. Bovendien is aangetoond dat de inhoud en functie van exosomes hangt af van de oorspronkelijke cel en de omstandigheden waaronder zij worden geproduceerd. Een verscheidenheid van functies zijn demonengeconcentreerd voor exosomes, zoals inductie van tolerantie tegen allergeen 7,8, de uitroeiing van de gevestigde tumoren in muizen 9, inhibitie en activatie van natural killer cellen 10-12, bevordering van differentiatie in T-regulerende cellen 13, stimulatie van T-cel proliferatie 14 en inductie van T cel apoptose 15. Jaar 2007 hebben wij aangetoond dat exosomes vrijkomen uit mestcellen messenger RNA (mRNA) en microRNA (miRNA) bevatten, en dat de RNA kan worden geschuif van de ene cel naar de andere via exosomes. In de ontvangende cellen, werd het mRNA geschuif door exosomes aangetoond worden vertaald in eiwit, wat wijst op een regulerende functie van de overgedragen RNA 16. Verder hebben we ook aangetoond dat exosomes afgeleid van cellen gekweekt onder oxidatieve stress kan tolerantie te induceren tegen verdere stress in ontvangende cellen en dus wijzen op een biologische functie van de exosomal shuttle RNA 17. Celcultuur media en biologische vloeistoffen contain een mengsel van blaasjes en schuur fragmenten. Een hoge kwaliteit isolatie methode voor exosomes, gevolgd door karakterisering en identificatie van de exosomes en hun inhoud, is daarom van cruciaal belang om exosomes onderscheiden van andere blaasjes en deeltjes. Hier presenteren we een methode voor de isolatie van exosomes van beide celcultuurmedium en lichaamsvloeistoffen. Deze isolatie methode is gebaseerd op herhaalde centrifugeren en filtreren stappen, gevolgd door een laatste ultracentrifugatie stap waarin de exosomes zijn pellets. Belangrijke methoden om de exosomes identificeren en karakteriseren van de exosomal morfologie en het eiwitgehalte worden gemarkeerd, met inbegrip van elektron microscopie, flow cytometrie en Western blot. De zuivering van het totaal exosomal RNA is gebaseerd op de spin-kolom chromatografie en de exosomal RNA opbrengst en de grootteverdeling is geanalyseerd met behulp van een Bioanalyzer.
Bij het bestuderen van de moleculaire inhoud en / of functie van exosomes, is het cruciaal om een hoge kwaliteit isolatie-methode dat een adequate opbrengst en de laagst mogelijke mate van vervuiling biedt gebruiken. De methodiek zoals beschreven in dit artikel is een gevestigde aanpak voor het isoleren exosomes en om hun RNA-inhoud en biologische functie te bestuderen. Verder wordt het belang van de karakterisering van het geïsoleerde exosomes, door een combinatie van verschillende methoden, waaronder elektronenmicroscopie, flow cytometrie en Western blot, gemarkeerd.
Bij het isoleren exosomes, is de eerste stap centrifugeren (300 xg) gebruikt om de pellet cellen die aanwezig kunnen zijn in de cel schorsing of de onderzochte biologische vloeistof. De tweede centrifugatie bij 16 500 xg moet voldoende sterk zijn om pellet dode cellen, grotere puin, apoptotische lichamen en andere organellen. Na deze centrifugeren, sommige protocollen omvatten een nano-filtratie stap, maar sommige investigators hebben uitgesloten, deze stap. Maar we benadrukken het belang van het uitbannen fragmenten en blaasjes groter dan 200 nm en daarom adviseren inclusief een filtratie stap. Indien een strengere isolatie nodig is, kan 100 nm filters worden gebruikt, maar rekening mee dat als viskeuze vloeistoffen worden gebruikt, deze filters gemakkelijk kunnen worden geblokkeerd en exosomal materiaal verloren gaat. Ook kan een 100 nm filtratie van invloed op de morfologie van de exosomes en voorts indien exosomes bevinden zich op de grotere schaal zij zouden verloren gaan. Zo is de 200 nm filters lijken geschikt voor exosome isolatie. Na de filtratie, is de verplichte ultracentrifugatie bij 120.000 xg gebruikt om de pellet exosomes. De exosomes kan verder worden gewassen met PBS, gebonden aan antilichamen gecoate kralen en gewassen, of op een sucrose gradiënt om vervuiling eiwitten te verwijderen. Dit kan echter een zeer hulpbronnen verbruiken proces dat we beweren niet nodig te zijn, vooral als het uitgangspunt monster volume is klein en / of het RNA-inhoud of de exosomes laag is, als extra stap zal aanzienlijk afnemen van het materiaal verder. Maar, nogmaals, moet de aard van het geïsoleerde blaasjes worden bewezen door de aanwezigheid en afwezigheid van bepaalde eiwitten.
Tot op heden is er geen absoluut uniek eiwit marker voor exosomes geïdentificeerd om te controleren of de steekproef exosomes en niets anders bevat. Als gevolg hiervan zijn een combinatie van methoden nodig is om de exosomes, met inbegrip van de bepaling van de grootte en morfologie van de exosomes door elektronenmicroscopie karakteriseren. Ook kan de zuiverheid van het monster bepaald worden met behulp van elektronenmicroscopie, omdat deze methode kan een overzicht van de mate van verontreiniging van het monster, bijvoorbeeld met grotere blaasjes, zoals microdeeltjes, apoptotische lichamen of mobiele puin. Bovendien kan het eiwitgehalte van de exosomes worden bepaald door middel van flowcytometrie en Western blot, en de combinatie van deze twee methoden resulteert in een analyse van zowel het membraan gebonden (bijv. CD63 enCD81) en geïnternaliseerd eiwitten (bv. Tsg101 en Alix) van de exosomes. Detectie van eiwitten verrijkt met exosomes, zoals CD63, Tsg101 en Alix, en de afwezigheid van eiwitten zoals het endoplasmatisch reticulum eiwit calnexin, is een indicatie dat de exosome verrijkte pellet inderdaad exosomes en niet besmetten blaasjes van de andere compartimenten van de cel.
Het profiel van de RNA die wordt gedetecteerd in exosomes is fundamenteel anders dan die van de RNA aangetroffen in intacte cellen. Zo exosomal RNA geanalyseerd door Bioanalyzer of in gel op basis van RNA-analyse methoden ontbreken de twee pieken voor de 18S en 28S rRNA subeenheden, die prominent in de analyse van cellulaire RNA. Wij zijn dan ook stellen dat de detectie van significante hoeveelheden rRNA in een monster blijkt dat de geëxtraheerde totaal RNA niet van exosomal oorsprong alleen, en dus dat de isolatie-methode moet worden verbeterd en de kwaliteit verzekerd.
The authors have nothing to disclose.
Deze studie werd gefinancierd door de Zweedse Research Council (K2008-57x-20 676-01-3).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Exosome isolation | |||
Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 65670 | |
Quick-seal ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | Depending on the rotor used different tubes are needed. Ti70 (342414), Ti45 (345776) | |
Quick-Seal Cordless Tube Topper kit | Beckman Coulter | 358312 | |
Filtropur Syringe Filter, 0.20μm | Sarstedt | 83.1826.001 | For viscose fluids and/or large volumes, a Vacuum filtration system, 0.2 μm, from VWR International can be used instead (514-0600). |
Electron microscopy | |||
Formvar/carbon coated nickel grids | Ted Pella Inc | 1GN200 | |
Mouse-anti-human CD63 | BD Bioscience | 556019 | Final conc: 0.05μg/μl |
Isotype control; IgG1κ (MOPC 21) | Sigma-Aldrich | M9269 | Final conc: 0.05μg/μl |
Anti-Mouse IgG Gold Conjugate, 10 nm | Sigma-Aldrich | G7777 | Final conc: 1% |
LEO 912AB Omega Electron microscope | Carl Zeiss NTS | Or equivalent equipment. | |
Flow cytometry | |||
4μm aldehyd/sulphate latex beads | Interfacial Dynamics | 12-4000 | |
Antibody for coating of the latex beads | For example anti-CD63 from BD Bioscience (556019) | ||
Intelli-Mixer RM-2L | ELMI | Or equivalent equipment. | |
IgG from human serum | Sigma-Aldrich | I4506 | |
Antibodies for detection | BD Bioscience | For example: PE anti-CD63 (556020) PE anti-CD9 (555372) PE anti-CD81 (555676) Isotype control (555749) | |
BD FACSAria | BD Bioscience | ||
Western Blot | |||
Transsonic T 490 DH | ELMA | Or equivalent equipment. | |
Isolation of exosomal RNA and RNA analysis | |||
miRCURY RNA Isolation Kit | Exiqon A/S | 300110 | |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939A |