本文演示的外来隔离,净化和检测,以及其分子的内容分析技术的方法。这些方法适应切体细胞培养基和生物体液隔离,并可以分析分子的内容以外,还可以在功能的研究非常有用。
切体研究领域正在迅速扩大,在出版物近年来急剧增加。这些小囊泡内吞的起源(30-100纳米)首先提出功能的一种方式为网织红细胞,以消除转铁蛋白受体,而成熟红细胞 1,后来被命名为外来。外来体是由外来萌芽后期内涵体产生多泡机构(MVBs),形成,并释放到环境中的融合与质膜 2 MVBs 。首次发现的外来以来,一个广泛的细胞已被证明释放这些囊泡。外来体也已在几种生物体液,包括血浆,鼻腔灌洗液,唾液和乳汁3-6中检测到。此外,它已被证明外来的内容和功能取决于原始细胞和在何种情况下他们的生产条件。多种功能已被恶魔trated为外来体,如诱导对过敏原7,8,建立肿瘤根除小鼠9,激活自然杀伤细胞的抑制和10-12,促进分化为调节性T细胞,刺激T细胞增殖 14的耐受性和诱导T细胞凋亡15。 2007年,我们证明,从肥大细胞释放的外来包含信使RNA(mRNA)和microRNA(miRNA)的,和RNA可以从一个细胞到另一个通过外来穿梭。在受体细胞中,外来穿梭的mRNA被翻译成蛋白质,表明监管职能的转移核糖核酸 16 。此外,我们还表明,氧化胁迫下生长的细胞派生的外来可诱导对进一步强调在受体细胞耐受性, 因此建议的17 exosomal穿梭RNA的生物学功能。细胞培养和生物体液中的合作ntain囊泡的混合物,并流下片段。一个高品质的外来隔离方法,由外来,其内容的表征和鉴定,因此,以区别于其他的囊泡和颗粒的外来至关重要。在这里,我们目前的隔离从细胞培养液和体液的外来的方法。这种隔离方法的基础上反复离心,过滤步骤,最后的离心步骤,在其中的外来颗粒。突出重要的方法来识别外来和exosomal形态和蛋白质含量的特征,包括电子显微镜,流式细胞仪和免疫印迹。总exosomal RNA纯化是基于自旋柱层析和exosomal RNA的产量和粒度分布分析一个生物分析仪。
在研究分子的内容和/或外来体的功能,它使用高品质的隔离方法,提供了一个适当的产量和尽可能低的程度的污染,是至关重要的。本文中所描述的方法是行之有效的方法为隔离外来和研究他们的RNA含量和生物功能。此外,隔离外来的特性的重要性,由不同的方法,包括电子显微镜,流式细胞仪和Western blot,相结合,突出。
隔离外来体时,首先离心的步骤(300 XG)用于细胞悬液或研究的生物流体中的颗粒细胞可能。第二离心16 500 XG需要强大到足以沉淀的死细胞,较大的碎片,凋亡小体和其他细胞器。在此之后离心,一些协议,包括纳米过滤步骤,但一些INVestigators已经排除了这一步。然而,我们强调消除碎片和囊泡大于200纳米,因此强烈建议包括一个过滤步骤的重要性。如果需要更严格的隔离,可用于100纳米过滤器,但要注意,如果使用粘性流体,这些过滤器可以很容易成为阻塞和exosomal材料丢失。另外,100纳米过滤可能影响的外来的形态,此外,如果外来规模较大的是,他们可能会丢失。因此,200纳米过滤器似乎适合切体隔离。 120000 XG强制离心过滤后,用于颗粒的外来。外来可以进一步用PBS冲洗,势必抗体包被的磁珠洗,或放置在蔗糖梯度消除污染蛋白质。然而,这可以是一个非常消耗资源的过程中,我们认为没有必要,特别是如果起始样品体积小和/或RNA的内容f的外来体是低的,额外的步骤,将大幅减少进一步的材料。然而,孤立的囊泡的性质应证明的存在和缺乏某些蛋白质。
迄今为止,没有外来的绝对独特的蛋白标记已经确定,以确认样品中含有外来体,并没有别的。因此,需要相结合的方法来刻画外来体,包括确定的规模和形态的电子显微镜的外来。此外,样品的纯度可通过电子显微镜确定,这种方法可以提供较大的囊泡,如微粒,凋亡小体或细胞碎片,概述样品的污染程度,例如,。此外,在外来的蛋白质含量可确定通过流式细胞仪和Western blot,这两种方法的结果在分析双方的膜结合的约束(如CD63的CD81)和内在蛋白(如Tsg101基因和阿利克斯)的外来体。检测外来体,如CD63,TSG101和阿利克斯,缺乏蛋白质,如内质网蛋白calnexin丰富的蛋白质,是一个迹象表明,丰富的外切体颗粒的确是外来的和不污染其他车厢的细胞囊泡。
外来检测RNA的配置文件,在完整的细胞中发现的RNA是根本不同的。因此,生物分析仪或凝胶为基础的RNA分析方法分析exosomal RNA,缺乏为18S和28S rRNA的亚基,这是在分析RNA的突出两峰。因此,我们认为,rRNA的任何样品中的大量的检测表明,提取总RNA exosomal起源并不孤单,从而隔离的方法,需要加以改进和质量保证。
The authors have nothing to disclose.
这项研究是由瑞典研究理事会(K2008 – 57X – 20 676-01-3)的资助。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Exosome isolation | |||
Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 65670 | |
Quick-seal ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | Depending on the rotor used different tubes are needed. Ti70 (342414), Ti45 (345776) | |
Quick-Seal Cordless Tube Topper kit | Beckman Coulter | 358312 | |
Filtropur Syringe Filter, 0.20μm | Sarstedt | 83.1826.001 | For viscose fluids and/or large volumes, a Vacuum filtration system, 0.2 μm, from VWR International can be used instead (514-0600). |
Electron microscopy | |||
Formvar/carbon coated nickel grids | Ted Pella Inc | 1GN200 | |
Mouse-anti-human CD63 | BD Bioscience | 556019 | Final conc: 0.05μg/μl |
Isotype control; IgG1κ (MOPC 21) | Sigma-Aldrich | M9269 | Final conc: 0.05μg/μl |
Anti-Mouse IgG Gold Conjugate, 10 nm | Sigma-Aldrich | G7777 | Final conc: 1% |
LEO 912AB Omega Electron microscope | Carl Zeiss NTS | Or equivalent equipment. | |
Flow cytometry | |||
4μm aldehyd/sulphate latex beads | Interfacial Dynamics | 12-4000 | |
Antibody for coating of the latex beads | For example anti-CD63 from BD Bioscience (556019) | ||
Intelli-Mixer RM-2L | ELMI | Or equivalent equipment. | |
IgG from human serum | Sigma-Aldrich | I4506 | |
Antibodies for detection | BD Bioscience | For example: PE anti-CD63 (556020) PE anti-CD9 (555372) PE anti-CD81 (555676) Isotype control (555749) | |
BD FACSAria | BD Bioscience | ||
Western Blot | |||
Transsonic T 490 DH | ELMA | Or equivalent equipment. | |
Isolation of exosomal RNA and RNA analysis | |||
miRCURY RNA Isolation Kit | Exiqon A/S | 300110 | |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939A |