स्वचालित hydrophobic प्रोटीन शुद्धीकरण में प्रयोग के लिए सहभागिता क्रोमैटोग्राफी स्तंभ चयन

Summary

उपयुक्त हाइड्रोफोबिक बातचीत क्रोमैटोग्राफी (HIC) प्रोटीन शुद्धीकरण की प्रक्रिया में इस्तेमाल किया जा मीडिया की पहचान के लिए एक स्वचालित तरीका प्रस्तुत किया है. विधि एक तरल माध्यम दबाव क्रोमैटोग्राफी स्वचालित बफर सम्मिश्रण, गतिशील नमूना पाश इंजेक्शन, अनुक्रमिक स्तंभ चयन, बहु तरंगदैर्ध्य विश्लेषण के, और विभाजन अंश प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक संग्रह सहित प्रणाली का उपयोग किया जाता है.

Abstract

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction chromatography (HIC) commonly requires experimental determination (referred to as screening or “scouting”) in order to select the most suitable chromatographic medium for purifying a given protein ¹. The method presented here describes an automated approach to scouting for an optimal HIC media to be used in protein purification.

HIC separates proteins and other biomolecules from a crude lysate based on differences in hydrophobicity. Similar to affinity chromatography (AC) and ion exchange chromatography (IEX), HIC is capable of concentrating the protein of interest as it progresses through the chromatographic process. Proteins best suited for purification by HIC include those with hydrophobic surface regions and able to withstand exposure to salt concentrations in excess of 2 M ammonium sulfate ((NH₄)₂SO₄). HIC is often chosen as a purification method for proteins lacking an affinity tag, and thus unsuitable for AC, and when IEX fails to provide adequate purification. Hydrophobic moieties on the protein surface temporarily bind to a nonpolar ligand coupled to an inert, immobile matrix. The interaction between protein and ligand are highly dependent on the salt concentration of the buffer flowing through the chromatography column, with high ionic concentrations strengthening the protein-ligand interaction and making the protein immobile (i.e. bound inside the column) ². As salt concentrations decrease, the protein-ligand interaction dissipates, the protein again becomes mobile and elutes from the column. Several HIC media are commercially available in pre-packed columns, each containing one of several hydrophobic ligands (e.g. S-butyl, butyl, octyl, and phenyl) cross-linked at varying densities to agarose beads of a specific diameter ³. Automated column scouting allows for an efficient approach for determining which HIC media should be employed for future, more exhaustive optimization experiments and protein purification runs ⁴.

The specific protein being purified here is recombinant green fluorescent protein (GFP); however, the approach may be adapted for purifying other proteins with one or more hydrophobic surface regions. GFP serves as a useful model protein, due to its stability, unique light absorbance peak at 397 nm, and fluorescence when exposed to UV light ⁵. Bacterial lysate containing wild type GFP was prepared in a high-salt buffer, loaded into a Bio-Rad DuoFlow medium pressure liquid chromatography system, and adsorbed to HiTrap HIC columns containing different HIC media. The protein was eluted from the columns and analyzed by in-line and post-run detection methods. Buffer blending, dynamic sample loop injection, sequential column selection, multi-wavelength analysis, and split fraction eluate collection increased the functionality of the system and reproducibility of the experimental approach.

Protocol

1. बफर और नमूना तैयार तकनीकी ध्यान दें: सभी बफ़र्स प्रशीतित हो सकता है और इस प्रोटोकॉल के प्रत्येक कदम पर बर्फ या डिग्री सेल्सियस 4 में प्रदर्शन किया जाना चाहिए, जब तक अन्यथा नोट. कम तापमान है शुट्ठ प्रोटीन के क्षरण को रोकने और इष्टतम ऑपरेटिंग शर्तों सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है. एचआईसी मीडिया अलग जुदाई परिणाम अगर कमरे के तापमान पर संचालित हो सकता है और क्रोमैटोग्राफी प्रणाली एक 4 डिग्री सेल्सियस ठंडे कमरे या ठंड बॉक्स में संचालित किया जाना चाहिए. निम्नलिखित buffers की 500 मिलीलीटर की तैयारी: 200 मिमी नः 2 4 (बफर A1) के पीओ, 200 मिमी ना 2 4 HPO (बफर A2), और 4.8 एम (राष्ट्रीय राजमार्ग 4) 2 अतः 4 (बफर बी 2). विआयनीकृत पानी (बफर बी 1) भी इस्तेमाल किया जाएगा. देगास बफर इष्टतम chromatographic ऑपरेटिंग स्थितियों को सुनिश्चित करने के लिए. प्रणाली दल एक साथ A1 और A2 के लिए कम नमक एक फॉस्फेट क्षालन बफर उत्पन्न Buffers मिश्रण होगा और यह Buffers बी 1 और बी 2 मिश्रण होगाउच्च नमक अमोनियम सल्फेट शुरू बफर (2.4 एम (राष्ट्रीय राजमार्ग 4) 2 अतः 4) उत्पन्न करने के लिए. नमूना के 20 मिलीलीटर की तैयारी के लिए बफर बी 2 के 10 मिलीग्राम के साथ शुद्ध किया जा प्रोटीन युक्त सेल lysate के 10 मिलीग्राम के मिश्रण से भरा हुआ है. सेल lysate नमूना समाधान के अंतिम अमोनियम सल्फेट एकाग्रता लगभग 2.4 (राष्ट्रीय राजमार्ग 4) एम 2 अतः 4 हो सकता है, यह मोटे तौर पर शुरू बफर के बराबर बनाने चाहिए. सेल lysate ते बफर में बैक्टीरिया कोशिका गोली (10 मिमी Tris 1 मिमी EDTA, 8.0 पीएच) sonication या 10 मिनट के लिए 1 मिलीग्राम / मिलीग्राम lysozyme और centrifugation 3700 × जी के अलावा द्वारा पीछा resuspending द्वारा तैयार किया जा सकता है. एक कम प्रोटीन बंधन 0.45 माइक्रोन सिरिंज समाधान से बात कण को ​​हटाने के लिए फिल्टर के माध्यम से मिश्रण lysate बफर फ़िल्टर. बर्फ पर नमूना रखें जब तक यह प्रणाली में लोड किया जा करने के लिए तैयार है. 2. शारीरिक और DuoFlow क्रोमैटोग्राफी प्रणाली सेटअप नलसाजी सभी डिवाइस शक्ति सुनिश्चित करें और संचार कनेक्शन बना रहे हैं. उपकरण जीवविज्ञान DuoFlow क्रोमैटोग्राफी सॉफ्टवेयर पुस्तिका नियंत्रण खिड़की में दिखाई जानी चाहिए. उपकरणों का एक सारांश तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं. प्रणाली और पाइपलाइन आरेख के एक उदाहरण के चित्रा 2 में है. पंप वर्कस्टेशन और प्रणाली दल ऐसी है कि बंदरगाह नंबर एक तर्कसंगत अनुक्रम के बाद बंदरगाहों के लिए वाल्व के लिए बिजली के कनेक्शन देते हैं. भविष्य में संदर्भ के लिए संबंधित पोर्ट संख्या के साथ प्रत्येक वाल्व लेबल के. पंप वर्कस्टेशन और प्रणाली दल कंप्यूटर / नियंत्रक और क्रोमैटोग्राफी प्रणाली के बीच मुख्य संचार के कनेक्शन के रूप में सेवा करते हैं. वाल्व स्वचालित रूप से मान्यता प्राप्त होगा सॉफ्टवेयर में प्रदर्शित जब या तो डिवाइस से जुड़ा है. तकनीकी ध्यान दें: जबकि मैनुअल मोड में क्रोमैटोग्राफी ऑपरेटिंग सिस्टम, वाल्व स्वतंत्र रूप से नियंत्रित कर रहे हैं. देखभाल करने के लिए सत्यापित करें कि वांछित प्रवाह पथ कॉन्फ़िगर किया गया है, खासकर जब वाल्व स्विचन शौकीन की शुरुआत से पहले,एर प्रवाह. डूब A1, A2, बी 1, बी 2 और Buffers में Teflon टयूबिंग. सुनिश्चित करें बफर की पर्याप्त मात्रा में पूरे प्रोटोकॉल के लिए उपलब्ध हैं और कि टयूबिंग जलमग्न रहेगा. A1 buffers की 500 मिलीलीटर, A2, और बी 2 और बफर बी 1 की 1 एल तैयार करना पर्याप्त होगा. साहुल नमूना वाल्व और गतिशील नमूना पाश लोड हो रहा है के रूप में चित्रा 2 में और निर्माता के निर्देशों के प्रति सचित्र. नमूना नमूना वाल्व इनलेट (3 स्थिति) के टयूबिंग की छोटी लंबाई संभव का उपयोग करने के लिए पाश जोड़ें. यह नमूना लोड प्रक्रिया के दौरान मन्दन नमूना कम कर देंगे. टयूबिंग लंबाई के बीच नमूना, नमूना लोड पंप, और नमूना लोड हो रहा है वाल्व प्रवेश (स्थिति 2) कम से कम. यह नमूने का नमूना पाश लोड के लिए आवश्यक राशि कम हो जाएगा. 8 1/16 "आयुध डिपो तिरछी नज़र टयूबिंग के समान आकार जोड़े प्रत्येक जोड़ी के साथ, 1/4-28 female-to-1/4-28 महिला संघ द्वारा तैयार एक साथ शामिल हो गए दो स्तंभ के 1-8 पद के लिए जोड़े कनेक्ट. चयन वाल्व. 7 संघहै लाइन में स्तंभ चयन वाल्व पद 2-8 से जुड़े बाद क्रोमैटोग्राफी स्तंभों के लिए परीक्षण किया जा द्वारा प्रतिस्थापित किया जाएगा. एक स्थिति के साथ जुड़ा इनलाइन संघ क्रोमैटोग्राफी स्तंभ बाईपास के रूप में बनाए रखा जाएगा. तकनीकी नोट: सुनिश्चित करें टयूबिंग की एक जोड़ी के दोनों स्तंभ चयन वाल्व पर एक ही स्थिति से जुड़ा है. दोनों यूवी 4 तरंग दैर्ध्य / विज़ वेक्षक (QuadTec) दीपक और निश्चित तरंग दैर्ध्य 280 एनएम यूवी वेक्षक दीपक पर बारी. इस प्रोटोकॉल के लिए QuadTec द्वारा मापा जा तरंगदैर्य 214 एनएम, 280 एनएम, और 397 एनएम शामिल हैं. दोनों यूवी निश्चित तरंग दैर्ध्य वेक्षक और QuadTec के साथ 280 एनएम माप प्रणाली अतिरेक प्रदान करता है और डेटा वैधता सुनिश्चित करता है. सभी डिटेक्टरों की पुष्टि निर्माता के निर्देशों के अनुसार calibrated हैं. backpressure नियामक डिटेक्टरों में हवा बुलबुला संचय को कम करने के लिए आवश्यक है और डिटेक्टरों की धारा लेकिन पीएच निगरानी के अप स्ट्रीम स्थापित किया जाना चाहिए. यहाँ प्रस्तुत प्रणाली दो fractio शामिलn लेनेवालों, जो बाद रन प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक विश्लेषण के लिए पर्याप्त सुविधा प्रदान करता है. अंश लेनेवालों, धारा फाड़नेवाला, वाल्व, और फाड़नेवाला नियंत्रक चित्रा 2 में सचित्र रूप में देते हैं. 1 फाड़नेवाला वाल्व की स्थिति के लिए जुड़ा हुआ अंश कलेक्टर 12 मिलीलीटर संस्कृति ट्यूबों में 900 μl प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक भिन्न जमा है, जबकि अंश कलेक्टर स्थान 2 से जुड़े 96 प्लेटें microtiter में 100 μl प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक भिन्न एकत्रित करेगा. स्थिति 2 अंश कलेक्टर, फाड़नेवाला, वाल्व, और फाड़नेवाला नियंत्रक क्रोमैटोग्राफी वर्कस्टेशन के ऑफ़लाइन संचालित कर रहे हैं. फाड़नेवाला नियंत्रक जैव – रेड Econo ग्रेडियेंट पम्प के भीतर निहित है, तथापि, इस उपकरण के घटक पंप नहीं किया जाता है. "भाजित" विकल्प सेटिंग Econo ग्रेडियेंट पम्प पर प्रदर्शित किया जाएगा जब फाड़नेवाला वाल्व से जुड़ा है. सेट% 10 भाजित. स्थिति एक अंश कलेक्टर प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक (900 μl / अंश) का 90% जमा है, और स्थिति 2 अंश कलेक्टर के इकट्ठा होगा10% (100 μl / अंश). अंश लेनेवालों synchrony में अग्रिम दोनों संग्राहकों के अंश संख्या के लिए अनुमति देने के लिए एक दूसरे के अनुरूप होगा. स्थिति 2 एक microplate बूंद सिर के साथ अंश कलेक्टर पर मानक अंश कलेक्टर ड्रॉप सिर बदलें. microplate ड्रॉप सिर एक छोटे एपर्चर, जो 50% छोटे ड्रॉप आकार (यानी 25 के बजाय मानक 50 μl μl) का संग्रह परमिट और विशेष रूप से लाभकारी है जब एकत्रित ≤ 500 μl भिन्न है. परदे पर नियंत्रण पैनल का उपयोग, स्थिति 2 अंश कलेक्टर के सेट 1 नमूना / मिनट की दर पर प्लेटें 96 और अच्छी तरह से अग्रिम में भिन्न इकट्ठा. फाड़नेवाला नियंत्रक और स्थिति 2 अंश कलेक्टर के पहले क्रोमैटोग्राफी रन की शुरुआत के बाद मैन्युअल तुरंत शुरू हो जाएगा. स्थिति 2 अंश और microplate ड्रॉप सिर कलेक्टर बफर बी 1 के साथ फ्लश. 3. भड़काना सिस्टम लाइन्स, प्रोग्रामिंग भागो विधि, और Equilibratआईएनजी एचआईसी कॉलम साथ की प्रणाली दल प्रवेश लाइनों degassed A1, A2, B1, B2, प्रधानमंत्री वर्कस्टेशन पंप Buffers में जलमग्न, नमूना पाश कुल्ला, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार क्रोमैटोग्राफी सिस्टम फ्लश. सभी 4 दल प्रणाली inlets के साथ पूरा भड़काना कदम (A1, A2, बी 1 और बी 2) आदेश में शेष हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए. प्रणाली तैयारी जीवविज्ञान सॉफ्टवेयर के माध्यम से प्रणाली नियंत्रक के मैनुअल ऑपरेशन की आवश्यकता है. नमूना लोड वाल्व और बफर प्रवाह शुरू करने से पहले स्तंभ चयन वाल्व की सही स्थिति की पुष्टि. प्रणाली, के रूप में में 3.4-3.5 चरण में वर्णित के माध्यम से एक मैनुअल 1 मिलीग्राम / क्षालन बफर मिनट प्रवाह (0% बी) शुरू के लिए तैयार है. जीवविज्ञान कार्यक्रम सॉफ्टवेयर के सेटअप विंडो में, चुनें "फास्फेट बफर अमोनियम सल्फेट के साथ" और "बफर सम्मिश्रण का प्रयोग करें". A1: Buffers, A2, B1, और सेटअप विंडो में सूचीबद्ध बी 2 उन तैयार के अनुरूप की पुष्टि करें. मैन्युअल रूप से 1 मिलीग्राम / क्षालन बफर के मिनट के लिए प्रवाह की दर निर्धारित(0% बी). Backpressure निरीक्षण, चालकता, यूवी tracings, और पीएच के अनुरूप है और सामान्य परिचालन सीमा के भीतर रहते हैं. असामान्यताएं हवा या स्तंभ रुकावट है कि आगे बढ़ने के लिए पहले से संबोधित किया जाना चाहिए संकेत मिलता है. 5 मिलीलीटर प्रोद्धावन बफर के साथ सभी 8 स्तंभ चयन लाइनों फ्लश. 1 प्रवाह को रोकने के 2 स्थिति दोनों स्तंभ चयन वाल्व की स्थापना, और 1 प्रवाह / मिलीलीटर मिनट, 0% बी शुरू करने से यह मत करो स्तंभ चयन में 3-8 पद लाइनों के लिए दोहराएँ. स्तंभ चयन वाल्व के 2-8 पद के लिए 1 मिलीग्राम HiTrap एचआईसी कॉलम कनेक्ट. एक समय में एक स्तंभ के साथ 3.8-3.13 चरणों को पूरा करें. लो ध्यान दें जो के HIC स्तंभ के जो चयन वाल्व स्थिति में रखा जाता है. एचआईसी स्तंभ मीडिया विशेषताओं का एक सारांश तालिका 2 में सूचीबद्ध है. जीई हेल्थकेयर HiTrap स्तंभों की शारीरिक कनेक्शन जैव रेड DuoFlow प्रणाली के लिए है 1/4-28 उपयोग फिटिंग, M6, और Luer फिटिंग की एक श्रृंखला की आवश्यकता है. स्थिति स्तंभ 2 में चयन वाल्व जोड़ने संघ निकालें. एकजैव रेड और जीई हेल्थकेयर फिटिंग lign के रूप में 3 चित्र में सचित्र. DuoFlow के लिए नदी के ऊपर स्तंभ फिटिंग संलग्न. या दृढ़ता से नदी के ऊपर चयन वाल्व फिटिंग के लिए नदी के ऊपर स्तंभ फिटिंग संलग्न द्वारा स्तंभ टयूबिंग में हवाई बुलबुले को फँसाने से बचें. फिटिंग के माध्यम से भागो क्षालन बफर जब तक सब हवा निष्कासित कर दिया है और बफर की एक बड़ी गिरावट मौजूद है. अस्थायी रूप से बफर प्रवाह बंद करो. स्तंभ प्रवेश से जुड़े डाट निकालें और कम नमक बफर के एक बड़े स्तंभ के शीर्ष पर ड्रॉप (0% बी) जगह है. नदी के ऊपर फिटिंग के लिए स्तंभ देते हैं. दोनों स्तंभ प्रवेश और प्रवेश बफर की बूंदों के साथ बह निकला फिटिंग के बाद हवा के बुलबुले के एक मुफ्त कनेक्शन सुनिश्चित करता है. यदि स्तंभ में पहली बार के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, स्तंभ आउटलेट अंत तस्वीर. नीचे की ओर स्तंभ फिटिंग और चयन वाल्व टयूबिंग आउटलेट देते हैं. सत्यापित करें सभी फिटिंग कसकर बांधा जाता है. 40 साई backpressure सीमा निर्धारित करें. स्तंभ डब्ल्यू धोith क्षालन बफर के 5 स्तंभ (5 स्तंभ संस्करणों = 5 मिलीलीटर) 1 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर (0% बी) संस्करणों. स्तंभ धो जारी रखें, यदि आवश्यक हो, पीएच तक, के यूवी tracings और backpressure स्थिर है. 10 कॉलम (10 मिलीलीटर) 1 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह की दर (100% बी) में शुरू बफर संस्करणों के साथ स्तंभ धो लें. यदि आवश्यक स्तंभ धो जारी रखें, जब तक पूर्ववर्ती के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कदम चालकता में सूचीबद्ध सिस्टम पैरामीटर स्थिर है. एचआईसी ऊपर तैयार स्तंभ अब नमूना लोड हो रहा है के लिए तैयार है. एक बार सभी स्तंभों के लिए परीक्षण किया जा तैयार कर रहे हैं, मैन्युअल रूप से 1 स्थिति (संघ) के लिए स्तंभ चयन वाल्व स्विच और बफर प्रवाह बंद करो. 4. नमूना लोड हो रहा है 20 मिलीलीटर नमूना में डूब नमूना प्रवेश टयूबिंग गतिशील नमूना पाश में लोड हो रहा है नमूना की प्रक्रिया शुरू करने के लिए. जीवविज्ञान सॉफ्टवेयर के मैनुअल सेटिंग खिड़की से, नमूना पाश लोड स्विच / 1 स्थिति (नमूना) और नमूना लोड हो रहा है शुद्ध वाल्व वाल्व धोना. की कार्रवाई आरंभनमूना पाश लोड हो रहा है पंप, 1 मिलीग्राम / मिनट की एक नमूना के बाद तुरंत जब तक प्रवाह दर पर नमूना पंप टयूबिंग में ड्राइंग नमूना लोड हो रहा है वाल्व तक पहुँचता है. इस बफर और या नमूना भार लाइन से हवा / हटाता है. लोड हो रहा है पंप के प्रवाह को रोकने और शुद्ध से नमूना लोड हो रहा है वाल्व स्विच करने के लिए लोड. 1 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर नमूना पाश लोड हो रहा है पंप को पुनरारंभ करें जब तक नमूना के 10 मिलीलीटर गतिशील नमूना पाश में तैयार किया गया है. पर्याप्त नमूना अब गतिशील नमूना पाश में 10 अनुक्रमिक एचआईसी स्तंभ स्काउटिंग रन के लिए भरी हुई है. 5. सॉफ्टवेयर प्रोग्रामिंग विधि और स्तंभ स्काउटिंग प्रोटोकॉल चल रहा है जीवविज्ञान सॉफ्टवेयर पर सेटअप विंडो से, तालिका 1 में एक asterisk के साथ चिह्नित प्रणाली उपकरणों का चयन करें. परख के लिए 6 एचआईसी स्तंभों का चयन करें. एक रेखीय उतरते नमक ढाल और 6 स्तंभ स्काउटिंग विधि, कार्यक्रम के रूप में 3 तालिका में सचित्र. विधि कार्यक्रम एक modificat है हैजीवविज्ञान सॉफ्टवेयर एचआईसी स्तंभ की स्थापना के आयन और मौजूदा अनुप्रयोग के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है. एक 6-स्तंभ स्काउटिंग विधि अंश कलेक्टर सीमाओं के कारण की सिफारिश की है. सभी 7 कॉलम अगर कार्यक्रम विधि बड़ा अंश संस्करणों को एकत्र करने के लिए समायोजित किया जा सकता है scouted. जोड़ने जब तक अन्यथा कार्यक्रम पूरा हो गया है, के रूप में स्काउटिंग सुविधा का चयन बाद में संपादन रोकता है स्काउटिंग कदम नहीं है. स्काउटिंग रन शुरू करो. मैन्युअल रूप से शुरू बफर शुरू (100% बी) प्रवाह, 1 मिलीग्राम / मिनट. प्रेस फाड़नेवाला नियंत्रक पर शुरू करने के लिए 90% 12 मिलीलीटर संस्कृति ट्यूब अंश (1 स्थिति) कलेक्टर और 96 अच्छी तरह से थाली अंश (स्थिति 2) कलेक्टर, क्रमशः के बीच -10% प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक धारा के बंटवारे शुरू. तकनीकी ध्यान दें: 96 अच्छी तरह से थाली अंश कलेक्टर जीवविज्ञान सॉफ्टवेयर से ऑफ़लाइन चलाया जा रहा है याद करते हैं. भागो कार्यक्रम विधि. कार्यक्रम विधि रन शुरू करने के तुरंत बाद, ऑफ़लाइन 96 अच्छी तरह से थाली fractio के परदे पर नियंत्रण कक्ष पर शुरू दबाएँपता कलेक्टर. यदि दो अंश कलेक्टरों के 100% तुल्यकालिक नहीं हैं, मैन्युअल रूप से अन्य अंश दूसरे अंश संग्रह ट्यूब कलेक्टर अग्रिम के रूप में ऑफ़लाइन 96 अच्छी तरह से थाली अंश कलेक्टर अग्रिम. वास्तविक समय प्रदर्शन का निरीक्षण करने के लिए प्रत्याशित रन मानकों की पुष्टि करने के लिए. Backpressure, चालकता, और% बी (चित्रा 4) पैरामीटर है कि reproducibility चलाने शर्तों के स्तंभ को स्तंभ सुनिश्चित करने के लिए नजर रखी जा सकती चलाए जा रहे हैं. वाल्व स्थिति, पीएच, और नमूना लोड भी निगरानी की जानी चाहिए. यूवी tracings क्षालन चोटियों के माध्यम से प्रवाह इसी तरह की पुष्टि करने के लिए तुलना की जा सकती है. लाइन और बाद रन प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक विश्लेषण तकनीक का उपयोग करने के लिए क्षालन प्रोफ़ाइल और ब्याज की प्रोटीन (यानी "लक्ष्य प्रोटीन) की शुद्धि की पहचान. GFP युक्त नमूने के लिए, लाइन में प्रोटीन की अद्वितीय यूवी absorbance के 397 एनएम का उपयोग क्षालन निरीक्षण करते हैं. GFP विशिष्ट 397 एनएम absorbance के सामान्य प्रोटीन 280 एनएम लिए सापेक्ष जुदाई का अनुमान अनुरेखण absorbance के अनुरेखण की तुलना करेंऔर अलग एचआईसी जा रहा है मीडिया का उपयोग कर शुद्धि scouted (चित्रा 5). GFP और अन्य लक्ष्य प्रोटीन के विश्लेषण के बाद कई विधियों के माध्यम से पूरा किया जा सकता है. 5-50 μl 96 अच्छी तरह से थाली भागों से aliquots एक ताजा थाली करने के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है और विशिष्ट प्रोटीन सामग्री के लिए द्वारा एलिसा या पश्चिमी धब्बा assayed है, और प्रत्येक अंश की कुल प्रोटीन सामग्री पारंपरिक एसडीएस पृष्ठ या एक का उपयोग करके विश्लेषण किया जा सकता है experion microfluidic के वैद्युतकणसंचलन प्रणाली. GFP प्रतिदीप्ति 12 मिलीलीटर संस्कृति के यूवी प्रकाश (चित्रा 6) का उपयोग कर ट्यूब में पाया जा सकता है. सबसे होनहार एचआईसी मीडिया की पहचान GFP क्षालन अन्य नमूने में निहित प्रोटीन के रिश्तेदार की तुलना द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. सबसे होनहार एचआईसी मीडिया के साथ शुद्धि तो शुरू बफर और पीएच के प्रकार और एकाग्रता सहित अन्य मापदंडों के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है. तकनीकी नोट: प्रयोग के समापन पर, बफर बी 1 में सभी प्रवेश लाइनों की जगह (degassedएच ओ 2) और अच्छी तरह से पानी के साथ पंप, वाल्व, और सभी टयूबिंग कुल्ला करें. और क्रोमैटोग्राफी प्रणाली और एचआईसी कॉलम की लंबी अवधि के भंडारण की सफाई के लिए निर्माताओं के निर्देशों का पालन करें. 6. प्रतिनिधि परिणाम: प्रतिनिधि एचआईसी नमक ढाल, चालकता, और स्काउटिंग रन का स्तंभ दबाव चित्रा 4 में प्रस्तुत कर रहे हैं. नमक एकाग्रता (नीली रेखा), के रूप में बफर का प्रतिशत उच्च नमक बफर लाइनों से तैयार द्वारा मापा में परिवर्तन एचआईसी पद्धति की खासियत है. के रूप में नमक एकाग्रता कम हो जाती है, प्रोटीन स्तंभ elute करने के लिए बाध्य है. चालकता, (लाल रेखा), जो मनाया नमक एकाग्रता के लिए मेल खाती लाइन में तुरंत QuadTec और यूवी का पता लगाने के बाद मापा जाता है. बंद नमक ढाल और चालकता tracings के बीच निर्धारित समय के लिए आवश्यक बफर बफर प्रवेश से यात्रा करने के लिए, इस प्रणाली के माध्यम से, और चालकता की निगरानी के लिए इंगित करता है. नमूना रन, टी के दौरानवह प्रणाली (धूसर लाइनों) के दबाव और पीएच अपेक्षाकृत स्थिर रहते हैं. चित्रा 5 अनुक्रमिक एचआईसी स्तंभ स्काउटिंग रन की chromatograms से पता चलता है. कुल (280 एक, नीली रेखा) प्रोटीन और GFP (एक 397, ग्रीन लाइन) का पता लगाने में लाइन 280 एनएम और 397 एनएम के प्रकाश के absorbance के मापने के द्वारा पूरा किया है, क्रमशः. यह लगभग सापेक्ष GFP बहुतायत और हर स्काउटिंग चलाने के लिए दो पंक्तियों की तुलना द्वारा अलग करने के लिए संभव है. GFP आत्मीयता और अपने क्षालन प्रोफ़ाइल के विभिन्न डिग्री विविध साथ परीक्षण एचआईसी स्तंभों के लिए बाध्य है. भविष्य Purifications के लिए एक पसंदीदा एचआईसी स्तंभ का चयन स्तंभ है कि तीव्र GFP क्षालन शिखर और अन्य प्रोटीन से सबसे बड़ी जुदाई की पहचान पर आधारित है. चित्रा 6 में, 10 भागों, 12, 14, 16, और 18 फिनायल एफएफ (उच्च उप) रन स्काउटिंग के लिए संस्कृति ट्यूब परिवेश कमरे के तहत कल्पना (फ्लोरोसेंट) प्रकाश और अल्ट्रावायलेट प्रकाश (यूवी). ट्यूब दोनों (बाईं पैनलों) चेहरा आगे और ऊपर से नीचे (सही पैनल) क्रम में विशेषता GFP उत्सर्जन स्पेक्ट्रम का पालन देखा गया. GFP (हरा) स्पष्ट रूप से दोनों यूवी छवियों में 14 अंश में पाया गया. इन के बाद रन डेटा 397 एनएम (एक 397, ग्रीन लाइन), जो भी eluted GFP के प्रमुख शिखर युक्त के रूप में 14 अंश की पहचान पर प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक absorbance के द्वारा मापने लाइन में GFP का पता लगाने के साथ अच्छी तरह से अनुरूप हैं. बाईं यूवी पैनल में फैलाना नीले प्रकाश यूवी लैम्प से उत्सर्जित होता है. आकृति 1. इस प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. बैक्टीरियल ब्याज की प्रोटीन युक्त lysate (GFP, लक्ष्य प्रोटीन) के लिए तैयार है, उच्च नमक बफर क्रोमैटोग्राफी शुरू बफर करने के लिए बराबर में पतला है, और फ़िल्टर. एक बार तरल क्रोमैटोग्राफी प्रणाली तैयार है, नमूना भरा हुआ है और लक्ष्य प्रोटीन अन्य प्रोटीन से अलग है मैं निहितएक hydrophobic क्रोमैटोग्राफी मध्यम एक पूर्व पैक एचआईसी स्तंभ में निहित का उपयोग lysate एन. जुदाई विधि अलग क्रोमैटोग्राफी मीडिया (स्तंभ स्काउटिंग के रूप में संदर्भित) का उपयोग करने के लिए निर्धारित करने के लिए जो मीडिया का सबसे अच्छा GFP जुदाई प्रदान करता है कई बार दोहराया जाता है. eluted प्रोटीन (प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक) के विश्लेषण में लाइन क्रोमैटोग्राफी प्रणाली में शामिल डिटेक्टरों का उपयोग करने और इसे बाद में विश्लेषण (रन) के लिए छोटे भागों में एकत्र किया जाता है. GFP गतिविधि के विश्लेषण में लाइन और बाद रन और जुदाई, एक इष्टतम एचआईसी स्तंभ और chromatographic मध्यम के आधार पर पहचान कर रहे हैं. तालिका 1 कुंजी क्रोमैटोग्राफी प्रणाली इस प्रोटोकॉल में उपयोग घटकों. चित्रा 2 जैव रेड DuoFlow मध्यम दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी नियोजित प्रणाली का आरेख. Sy की मुख्य विशेषताएंस्वचालित बफर लोड हो रहा है, नमूना के अनुक्रमिक स्तंभ रन के लिए, अलग क्रोमैटोग्राफी स्तंभों के स्वचालित चयन सम्मिश्रण, प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक के विश्लेषण में लाइन, और fractionated प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक मिलकर संग्रह शामिल स्टेम. और जानकारी के लिए 1 टेबल पाठ देखें. एचआईसी मीडिया की तालिका 2. की biophysical विशेषताओं का परीक्षण किया. HiTrap एचआईसी स्तंभ का नाम ligand, ligand, घनत्व, और मनका आकार का संकेत है. * एफएफ = तेजी से प्रवाह, हिमाचल प्रदेश = उच्च प्रदर्शन. बड़ा मनका आकार ligand के बंधन क्षमता और प्रवाह की दर बढ़ जाती है. छोटे मोती आकार chromatographic संकल्प बढ़ जाती है. सूचना निर्माता द्वारा प्रदान की साहित्य से व्युत्पन्न है. चित्रा 3. जीई हेल्थकेयर HiTrap एचआईसी स्तंभ के जैव रेड DuoFlow, नदी के ऊपर 1/4-28 Delrin अखरोट system.To के लिए कनेक्शनएन डी (A1) के सामी, एक पुरुष Luer से महिला 1/4-28 (बी 1) फिटिंग और पुरुष 1/16 "- महिला Luer फिटिंग (सी) जुड़ा हुआ है. फिटिंग होने के बाद HiTrap स्तंभ के लिए देते रहे हैं बफर के साथ प्लावित कर रहे हैं और सभी बुलबुले को हटा स्तंभ आउटलेट एक महिला 1/16 "करने के लिए पुरुष M6 फिटिंग (डी) से जुड़ा है. पुरुष Luer महिला M6 (ई), फिटिंग और महिला Luer से महिला 1 4-28 / फिटिंग (2 बी). इस पूरे विधानसभा बहाव 1/4-28 Delrin अखरोट और सामी (2 ए) के लिए जुड़ा हुआ है. ऊपरी पैनल से पता चलता है फिटिंग अलग और कम पैनल से पता चलता है फिटिंग इकट्ठे. कदम # मात्रा (एमएल) विवरण पैरामीटर 1 0.00 पूरे चलाने के दौरान 1.0 एमएल भिन्न ले लीजिए 2 0.00 Switचर्चा स्तंभ एचआईसी स्तम्भ 1 (स्थिति 2) 3 0.00 Isocratic फ्लो पीएच: 6.80 100% बी मात्रा: 2.00 एमएल प्रवाह: 1.00 एमएल / मिनट 4 2.00 शून्य बेसलाइन QuadTec 5 2.00 शून्य बेसलाइन यूवी वेक्षक 6 2.00 नमूना इंजेक्षन नमूना लोड गतिशील लूप ऑटो वाल्व इंजेक्षन हैं मात्रा: 0.50 एमएल प्रवाह: 1.00 एमएल / मिनट 7 3.00 Isocratic फ्लो पीएच: 6.80 100% बी मात्रा: 5.00 एमएल प्रवाह: 1.00 एमएल / मिनट 8 8.00 रैखिक ढाल पीएच: 6.80 100% बी -> 0% बी मात्रा: 10.00 एमएल प्रवाह: 1.00 एमएल/ मिनट 9 18.00 Isocratic फ्लो पीएच: 6.80 0% बी मात्रा: 3.00 एमएल प्रवाह: 1.00 एमएल / मिनट 10 21.00 Isocratic फ्लो पीएच: 6.80 100% बी मात्रा: 5.00 एमएल प्रवाह: 1.00 एमएल / मिनट 11 26.00 स्विच कॉलम संघ (स्थिति 1) अंत 26.00 प्रोटोकॉल का अंत 5 अतिरिक्त एचआईसी स्तंभों के साथ स्वतः दोहराता (3-7 पद) प्रकार स्काउट रनों की संख्या: 6 कदम की संख्या Scouted: 1 तालिका 3. एचआईसी स्काउटिंग नियोजित विधि के लिए जीवविज्ञान सॉफ्टवेयर प्रोटोकॉल. <img alt = "चित्रा 4" "> चित्रा 4 प्रतिनिधि एचआईसी नमक ढाल, चालकता, और स्तंभ दबाव. के रूप में नमक एकाग्रता (नीली रेखा) कम हो जाती है, चालकता (लाल रेखा) के रूप में अच्छी तरह से करता है. नमक ढाल और चालकता tracings के बीच बंद सेट बफर के लिए आवश्यक समय बफर प्रवेश से चालकता की निगरानी के लिए यात्रा को इंगित करता है. सिस्टम दबाव (धूसर लाइनों) अपेक्षाकृत से स्काउटिंग रन की अवधि के लिए निरंतर बनी हुई है. आंकड़ा को अनुक्रमिक HiTrap एचआईसी स्तंभ की 5. संकलित chromatograms रन स्काउटिंग. कुल (280 एक, नीली रेखा) प्रोटीन और GFP (एक 397, ग्रीन लाइन) का पता लगाने में लाइन 280 एनएम और 397 एनएम के प्रकाश के absorbance के मापने के द्वारा पूरा किया है, क्रमशः. प्रयोगों की इस श्रृंखला में, तीव्र GFP क्षालन शिखर फिनायल एफएफ (उच्च उप) ग के साथ मनाया गयाolumn. फिनायल एफएफ स्तंभ (उच्च उप) भी GFP और अन्य प्रोटीन के बीच सबसे बड़ी जुदाई प्रदान दिखाई दिया. अतिरिक्त 1 मिलीलीटर HiTrap के एचआईसी कॉलम शामिल फिनायल तेज प्रवाह कम प्रतिस्थापन परीक्षण किया गया (फिनायल एफएफ (कम उप)), butyl तेजी से (butyl एफएफ) प्रवाह, butyl – एस तेज प्रवाह (एफएफ butyl एस), और octyl तेज प्रवाह (एफएफ octyl,) . चित्रा 6 नमूना प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक में GFP के प्रतिनिधि दृश्य के बाद रन. प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक भिन्न 1/minute की दर से एकत्र किए गए थे, और प्रत्येक के GFP सामग्री के लिए विश्लेषण किया गया था. इस प्रतिनिधि आंकड़ा 10 भागों, 12, 14, 16, और 18 फिनायल एफएफ (उच्च उप) रन स्काउटिंग के लिए संस्कृति ट्यूब परिवेश (फ्लोरोसेंट) कमरे में रोशनी और पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के तहत देखे थे. ट्यूब दोनों चेहरा (बाएं पैनल) आगे और ऊपर से नीचे (सही पैनल) देखा गया. बाईं यूवी पैनल में फैलाना नीले प्रकाश यूवी लैम्प से उत्सर्जित होता है. GFP (हरा) इन्हीं में स्पष्ट रूप से पता चला हैदोनों यूवी छवियों में 14 tion. ऊपरी पैनल कुल प्रोटीन (A280, नीली रेखा) और GFP (एक 397, ग्रीन लाइन) 5 भागों की कल्पना की जा रहा है वर्णलेख tracings के इंगित करता है.

Discussion

तरल क्रोमैटोग्राफी तकनीक उच्च शुद्ध ⁶ प्रतिरक्षाविज्ञानी के संचालन के लिए आवश्यक, जैव रासायनिक ⁷ प्रोटीन की तैयारी, और संरचनात्मक ⁸ अध्ययन के लिए अमूल्य साबित किया है. एचआईसी शोधन तरीकों सबसे अक्सर एक पसंदीदा माध्यम के अनुभवजन्य दृढ़ संकल्प की आवश्यकता है, और ligand संरचना, ligand के घनत्व, और मैट्रिक्स मनका गुण सब chromatographic ^{2 परिणाम, 3} प्रभाव दिखाया गया है. स्वचालित स्काउटिंग स्तंभ बाद अनुकूलन और प्रोटीन ⁴ शुद्धि के लिए एक एचआईसी मध्यम का चयन करने के लिए एक कुशल दृष्टिकोण है. स्वचालित स्तंभ स्काउटिंग प्रस्तुत विधि आसानी से विभिन्न एचआईसी प्रोटीन शुद्धीकरण रणनीतियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. नमक एकाग्रता, नमक की पसंद, नमक ढाल, और पीएच में बदलाव और शुद्धि स्थितियों में सुधार हो सकता है और इन आवश्यक मापदंडों को अलग करने का प्रभाव पहले से किया गया है ^13,14 की समीक्षा की. एचआईसी एक आंशिक रूप से शुद्ध लक्ष्य prote युक्त प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलकमें आगे जा आयन एक्सचेंज (आईईएक्स) क्रोमैटोग्राफी या जेल / निस्पंदन आकार अपवर्जन ^9,10 क्रोमैटोग्राफी के रूप में एक पूरक chromatographic तकनीक का उपयोग कर शुद्ध कर सकते हैं.

अपनी अनूठी प्रकाश absorbance के उत्सर्जन और विशेषताओं की वजह से, GFP की प्रोद्धावन प्रोफ़ाइल में लाइन और बाद रन दृष्टिकोण का उपयोग कर पहचाना जा सकता है. कि अंत करने के लिए, इस प्रोटोकॉल आगे रीकॉम्बीनैंट GFP-संलयन प्रोटीन की शुद्धि के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जो में एक असंबंधित लक्ष्य के प्रोटीन GFP साथ है "टैग". GFP टैग लक्ष्य प्रोटीन यूवी प्रकाश ¹¹ और एचआईसी शुद्धि ऊपर वर्णित रणनीति सहित विभिन्न chromatographic दृष्टिकोण, का उपयोग शुद्ध के साथ पता लगाया जा सकता है. GFP शुद्धि भी आधुनिक प्रोटीन विज्ञान ¹² तकनीकों के शिक्षण के लिए जैव रसायन प्रयोगशालाओं में एक शैक्षणिक प्रधान बन गया है.

जबकि बुनियादी एचआईसी प्रोटीन शुद्धि एक काफी कम मजबूत क्रोमैटोग्राफी sy का उपयोग किया जा सकता हैस्टेम, उपकरण यहाँ प्रस्तुत करने के लिए अनुकूल परिणाम प्राप्त करने में सहायता के लिए विशिष्ट लाभ का एक संख्या है. एक अत्यधिक स्वचालित प्रणाली का उपयोग करने का उल्लेखनीय लाभ रन रन हालत reproducibility है, समय की बचत में सुधार शामिल हैं, और ¹⁰ प्रणाली में पेश किया जाना हवा के लिए अवसरों की कमी हुई. सिस्टम नियंत्रित बफर सम्मिश्रण, जो प्रणाली दल से मदद की है, के बफर तैयारी और प्रयोगात्मक reproducibility के में वृद्धि की स्थिरता के लिए अनुमति देता है. सभी स्काउटिंग के लिए गतिशील नमूना पाश में पर्याप्त नमूना लोड ड्राइंग चलाता आगे नमूना प्रत्येक स्तंभ के लिए जोड़ा जा रहा है की एकरूपता सुनिश्चित करता है और रुकावट या reloading के मैनुअल के बिना अनुक्रमिक रन के लिए अनुमति देता है. स्तंभ पर नमूना पाश से नियंत्रित नमूना इंजेक्शन परिवर्तनशीलता कि मैनुअल नमूना लोड हो रहा है के साथ हो सकता है कम हो जाती है. स्तंभ चयन वाल्व की एक जोड़ी लगातार नमूना रन, प्रत्येक एक अलग एचआईसी स्तंभ का उपयोग करने के लिए, लिए प्रणाली replumb बिना अनुमति देते हैं. एमयूएल प्रदर्शन ती – तरंग दैर्ध्य विश्लेषण विशेष रूप से लाभकारी है जब एक अद्वितीय spectrophotometric प्रोफ़ाइल के साथ एक प्रोटीन परख करने की क्रिया है. GFP के अलावा, cytochromes, flavoproteins,, और अन्य heme युक्त प्रोटीन इस तकनीक से फायदा हो सकता है. चालकता और पीएच निगरानी उपकरणों वास्तविक समय प्रयोगात्मक शर्तों के सत्यापन के लिए अनुमति देते हैं. भाजित अंश प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक संग्रह सुधार अंश से निपटने के लिए अनुमति देता है और बाद चलाने के विश्लेषण के तरीकों कि एक न्यूनतम नमूना मात्रा (जैसे एलिसा, एसडीएस पृष्ठ, पश्चिमी धब्बा, और Experion microfluidic के वैद्युतकणसंचलन) की आवश्यकता के लिए आसान हस्तांतरण के लिए सक्षम बनाता है. जबकि दूसरे अंश कलेक्टर ऑफ़लाइन ऑपरेटिंग पुस्तिका तुल्यकालन की आवश्यकता है, यह अंश कलेक्टर चयन में अधिकतम लचीलेपन के लिए अनुमति देता है. एचआईसी स्काउटिंग स्तंभ और प्रोटीन शुद्धि के लिए इस तरह के एक मजबूत क्रोमैटोग्राफी प्रणाली का उपयोग करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कमियां प्रारंभिक समय और बजट साधन अधिग्रहण और ऑपरेटर के प्रशिक्षण के साथ जुड़े व्यय शामिल हैं.

टी "> यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक जैव रेड DuoFlow, क्रोमैटोग्राफी प्रणाली का इस्तेमाल करता है, तथापि, जीई हेल्थकेयर से ÄKTA Avant के रूप में अन्य निर्माताओं, से समान रूप से मजबूत उपकरण भी उपयोग किया जा सकता है और बराबर परिणाम का निर्माण करने में सक्षम हैं भी तुलनीय क्रोमैटोग्राफी प्रणाली अद्वितीय विशेषताओं (उदाहरण के लिए विधि प्रोग्रामिंग, घटक नामकरण, ऑपरेटर वरीयता, scalability और सीमाओं) है कि एक शुद्धिकरण की प्रक्रिया या साधन अधिग्रहण शुरू करने से पहले विचार किया जाना चाहिए है.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
BioLogic DuoFlow Pathfinder 20 System	Bio-Rad	7602257	Includes system maximizer, mixer, F10 workstation, AVR7-3 valve, QuadTec UV/Vis detector with flow cell, BioFrac fraction collector, BioLogic software, and starter kit
AVR9-8 stream-select valve	Bio-Rad	7600408	High-pressure valve, 9-port, 8-position, 3,500 psi (233 bar) limit, for use with BioLogic DuoFlow system
Diverter valve SV3T-2	Bio-Rad	7600410	Solenoid valve, 3-port, 2-position, 30 psi (2 bar) limit, for use with BioLogic DuoFlow system
Stream splitter valve	Bio-Rad
DynaLoop 25 Kit	Bio-Rad	7500451	Sliding-piston sample loop kit, includes 25 ml DynaLoop sliding piston loop, DynaLoop parts kit (#750-0450)
BioFrac Fraction Collector	Bio-Rad	7410002	Two fraction collectors used
BioFrac microplate drop head adapter	Bio-Rad	7410088
BioFrac microtiter plate adapter	Bio-Rad	7410017
UV Optics Module	Bio-Rad	7500202
Halogen lamp	Bio-Rad	7601331
Econo Gradient Pump	Bio-Rad	7319001	gradient pump for low-pressure protein purification, includes tubing and fittings kit
Experion System	Bio-Rad	7007001
Experion Pro260 Analysis Kit	Bio-Rad	7007102
HiTrap HIC column selection kit	GE Healthcare	28-4110-07	Includes 7 x 1 ml pre-packed columns of HIC media for scouting
GE Healthcare-to-Bio-Rad column fittings	GE Healthcare	18111251 and 18111257