Mänskliga In Vitro Suppression som screeningmetod för erkännande av en tidig staten Immune obalans
Summary
Tregs är potenta dämpning av immunsystemet. Det finns en brist på unik yta markörer för att definiera dem, alltså, definitioner av Tregs är främst funktionell. Här beskriver vi ett optimerat<em> In vitro</em> Analys kan identifiera immuna obalans hos personer i riskzonen för att utveckla T1D.
Abstract
Regulatoriska T-celler (Tregs) är kritiska förmedlare av immuntolerans att själv antigener. Dessutom är de viktiga regulatorer av immunsvaret efter en infektion. Trots insatser för att identifiera unika yta markör på Tregs, är det enda unika med deras förmåga att undertrycka spridning och funktion effektor T-celler. Även om det är tydligt att endast in vitro-analys kan användas för att bedöma mänskliga Treg funktion, blir detta problematiskt när man bedömer resultaten från tvärsnittsstudier där friska celler och celler som isolerats från patienter med autoimmuna sjukdomar (som typ 1-diabetes-T1D) behöver som ska jämföras. Det finns en stor variation mellan laboratorier i antalet och typen av responder T-celler, typ och styrka av stimulering, Treg: responder nyckeltal och antalet och typen av antigen-presenterande celler (APC) som används inom human in vitro-hämning analyser. Denna variation gör att jämförelser mellan studier som mäter Treg funktion svårt. Den Treg område behöver ett standardiserat dämpning analysmetod som kommer att fungera bra med både friska försökspersoner och patienter med autoimmuna sjukdomar. Vi har utvecklat en in vitro-hämning analys som visar mycket lite inom assay variation i stimuleringen av T-celler isolerade från friska försökspersoner jämfört med personer med underliggande autoimmun förstörelse av bukspottkörtelns β-celler. Huvudsyftet med denna pjäs är att beskriva en in vitro-mänskliga dämpning analys som möjliggör jämförelser mellan olika ämnesgrupper. Dessutom har denna analys potential att avgränsa en mindre förlust i nTreg funktion och räknar med ytterligare förluster i framtiden, på så sätt identifiera patienter som kan dra nytta av förebyggande immunmodulerande behandling 1. Nedan ger vi utförlig beskrivning av stegen i detta förfarande. Vi hoppas kunna bidra till standardisering av in vitro-suppression test används för att mäta Treg funktion. Dessutom erbjuder vi denna analys som ett verktyg för att känna igen ett tidigt stadium av immun obalans och en potentiell funktionell biomarkör för T1D.
Protocol
Discussion
Som den enda unika funktion för Tregs bör repressiva funktion testas tillförlitligt och jämnt mellan ämnen i olika faser av sjukdomsutvecklingen inom samma och mellan olika studier. Vi erbjuder information om undertryckande test som utvecklats i vårt laboratorium som vårt bidrag till standardiseringen av denna analys. I vår omfattande optimering studie har vi fastställt att T-cell stimulering med anti-humana CD3-belagda kulor (UCHT1 klon, i koncentrationen av 1μg/ml (i motsats till kommersiellt tillgängliga 5…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av Max McGee nationellt forskningscentrum för unga Diabetesat Medical College of Wisconsin och barns Forskningsinstitut Wisconsin. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, eller beredning av manuskriptet.
Materials
| Name of the reagent or instrument | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque PLUS | Amersham Pharmacia Biotech | 17-1440-03 | |
| DPBS-1X | Gibco | 14190-144 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| anti-CD4 microbeads | Miltenyi | 130-045-101 | |
| Pre-separation filters | Miltenyi | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi | 130-042-401 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| Anti-human CD4-APCCy7 (clone RPA-T4) | BD Pharmingen | 557852 | |
| Anti-human CD25-PE (clone M-A251; IL-2Rα) | BD Pharmingen | 555432 | |
| Anti-human CD8-FITC (clone RPA-T8) | BD Pharmingen | 555366 | |
| Anti-human CD14-FITC (clone M5E2; LPS receptor) | BD Pharmingen | 555397 | |
| Anti-human CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR-type II) | BD Pharmingen | 555448 | |
| Anti-human CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα chain) | BD Pharmingen | 554532 | |
| Dynalbeads M-450 tosylactivated | Invitrogen | 140-13 | |
| Anti-human CD3 | Ancell | 144-024 | |
| Buffer1 | Homemade | 0.1M Na2B4O7 pH7.6 | |
| Buffer2 | Homemade | PBS/2mM EDTA/ 0.1% BSA pH7.4 | |
| Buffer3 | Homemade | 0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5 | |
| Complete RPMI media | Homemade | RPMI 1640 media 2 mM L-glutamine 5 mM HEPES 100 U/μg/ml peni/strept 0.5 mM sodium pyruvate | |
| [3H] thymidine | Perkin Elmer | NET027Z005MC | |
| human pooled AB serum | Atlanta Biologicals | S40110 | |
| Multiscreen harvest plate | Millipore | MAHFC1H60 | |
| Microscint 20 | Perkin Elmer | 6013621 |
Riferimenti
- Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1, 184-188 (2006).
- Nagaraja, T. N., Croxen, R. L., Panda, S., Knight, R. A., Keenan, K. A., Brown, S. L., Fenstermacher, J. D., Ewing, J. R. Application of arsenazo III in the preparation and characterization of an albumin-linked, gadolinium-based macromolecular magnetic resonance contrast agent. J. Neurosci. Methods. 157, 238-245 (2006).
- Supkowski, R. M., Horrocks, W. D. On the determination of the number of water molecules, q, coordinated to europium(III) ions in solution from luminescence decay lifetimes. Inorg. Chim. Acta. 340, 44-48 (2002).
- Menjoge, A. R., Kannan, R. M., Tomalia, D. A. Dendrimer-based drug and imaging conjugates: design considerations for nanomedical applications. Drug Discovery Today. 15, 171-185 (2010).
- Que, E. L., Chang, C. J. Responsive magnetic resonance imaging contrast agents as chemical sensors for metals in biology and medicine. Chem. Soc. Rev. 39, 51-60 (2010).
- Uppal, R., Caravan, P. Targeted probes for cardiovascular MR imaging. Future Med. Chem. 2, 451-470 (2010).
- Major, J. L., Meade, T. J. B. i. o. r. e. s. p. o. n. s. i. v. e. Bioresponsive, cell-penetrating, and multimeric MR contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 893-903 (2009).
- Datta, A., Raymond, K. N. Gd-hydroxypyridinone (HOPO)-based high-relaxivity magnetic resonance imaging (MRI) contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 938-947 (2009).
- Leôn-Rodríguez, L. M. D., Lubag, A. J. M., Malloy, C. R., Martinez, G. V., Gillies, R. J., Sherry, A. D. Responsive MRI agents for sensing metabolism in vivo. Acc. Chem. Res. 42, 948-957 (2009).
- Castelli, D. D., Gianolio, E., Crich, S. G., Terreno, E., Aime, S. Metal containing nanosized systems for MR-molecular imaging applications. Coord. Chem. Rev. 252, 2424-2443 (2008).
- Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99, 2293-2352 (1999).
- Lauffer, R. B. Paramagnetic metal complexes as water proton relaxation agents for NMR imaging: theory and design. Chem. Rev. 87, 901-927 (1987).
- Yoo, B., Pagel, . An overview of responsive MRI contrast agents for molecular imaging. Front. Biosci. 13, 1733-1752 (2008).
- Pandya, S., Yu, J., Parker, D. Engineering emissive europium and terbium complexes for molecular imaging and sensing. Dalton Trans. 23, 2757-2766 (2006).
- Nwe, K., Xu, H., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Ileva, L., Riffle, L., Wong, K. J., Brechbiel, M. W. A new approach in the preparation of dendrimer-based bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid MR contrast agent derivatives. Bioconjugate Chem. 20, 1412-1418 (2009).
- Nwe, K., Bernardo, M., Regino, C. A. S., Williams, M., Brechbiel, M. W. Comparison of MRI properties between derivatized DTPA and DOTA gadolinium-dendrimer conjugates. Bioorg. Med. Chem. 18, 5925-5931 (2010).
- Caravan, P., Das, B., Deng, Q., Dumas, S., Jacques, V., Koerner, S. K., Kolodziej, A., Looby, R. J., Sun, W. -. C., Zhang, Z. A lysine walk to high relaxivity collagen-targeted MRI contrast agents. Chem. Commun. , 430-432 (2009).
- Leôn-Rodríguez, L. M. D., Kovacs, Z. The synthesis and chelation chemistry of DOTA-peptide conjugates. Bioconjugate Chem. 19, 391-402 (2008).
- Boswell, C. A., Eck, P. K., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Wong, K. J., Milenic, D. E., Choyke, P. L., Brechbiel, M. W. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin αVβ3-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).
