Detta protokoll beskriver i synnerhet utvinning av totala IgY från äggula med hjälp av polyetylenglykol nederbörd och ger allmän information om IgY teknik.
Höns kan immuniserade med hjälp av im vaccination (Musculus pectoralis, vänster och höger, injektionsvolym 0,5-1,0 ml) eller med hjälp av Gene-Gun plasmid-immunisering. Beroende på immunogenicitet av antigenet, hög antikropps-titer (upp till 1:100,000 – 1:1,000,000) kan nås efter bara en eller från 3 till 4 uppsving vaccinationer. Normalt lägger ett hönsägg kontinuerligt under ca 72 veckor, därefter om kapaciteten minskar. Detta protokoll beskriver utvinning av totala IgY från äggula med hjälp av en nederbörd förfarande (PEG. Polson et al. 1980). Metoden innebär att två viktiga steg. Den första är att avlägsna lipider och den andra är utfällning av totala IgY från supernatanten i steg ett. Efter dialys mot en buffert (normalt PBS) i IgY-extrakt kan förvaras vid -20 ° C i mer än ett år. Renhet extraktet är runt 80%, varierar den totala IgY per ägg från 40-80 mg, beroende på ålder värphöns. Den totala IgY halten ökar med åldern på hönan från cirka 40 mg / ägg upp till 80 mg / ägg (om PEG nederbörd). Den om kapacitet på en höna per år är ca 325 ägg. Det innebär en total potentiell skörd på 20 g totala IgY / år baserat på en genomsnittlig IgY innehåll av 60 mg totalt IgY / ägg (se tabell 1).
Valet av en lämplig IgY reningsmetod påverkas av omfattningen av rening (laboratorium eller industri), kostnadseffektivitet, teknik (laboratorieutrustning) och miljöpåverkan (avfallshantering). Olika IgY extraktionsmetoder granskades i detalj av De Meulenaer & Huyghebaert (2001, för granskning se även Schade et al. 2005). I allmänhet kan dessa metoder delas in i tre huvudsakliga grupper:
Renheten av en IgY preparatet kan ökas genom en kombination av metoder, till exempel, kan PEG nederbörd kombineras med affinitetskromatografi. I vissa fall, beroende på den slutliga ansökan, är en vatten-extrakt av IgY tillräcklig för att uppnå goda resultat (Akita & Nakai 1993). Enligt vår erfarenhet arbetade IgY-provet vi får med PEG-fällning mycket bra i en massa olika immunologiska analyser. Genom att standardisera PEG-fällning metoden en teknisk assistent kan bearbeta ca 84 ägg per vecka, vilket motsvarar ett belopp på totalt IgY mellan 4 och 7 g per vecka. En enkel beräkning: En värphöna är immuniserade med ett antigen. Efter några uppsving vaccinationer hönan producerar specifika antikroppar (Ab) med en titer 1:50,000 under en period av 30 dagar. 30 ägg x 2 ml IgY extrakt (se protokoll och fig. 3). Motsvarar 60 ml totalt IgY, vilket i sin tur motsvarar en Ab utspädning av 3000 l (kapacitet en hink är 10 l), det betyder med 3000 l för Ab lösning 300 hinkar kan fyllas. Så, med tanke på så stora Ab-mängden är det inga problem att lagra en Ab-pool av jämn kvalitet och specificitet. Denna teknik minskar laddning / massa variabilitet annat observerats i polyspecifikt Ab.
Trots den aspekten av kvantitet, IgY Ab har ytterligare fördelar jämfört med däggdjur IgG: Ingen aktivering av däggdjur komplementsystemet, ingen korsreaktivitet med HAMA (human anti mus antikropp), reumatoid faktorer eller blod antigener grupp (brist på heteroagglutinins).
En enastående fördel med IgY-Ab är den så kallade fylogenetiska avstånd. Fylogenetiska avstånd är orsaken till den ofta beskrivs skillnaderna mellan Ab särdrag däggdjur och höns, även när identiskt vaccineras. Förutom skillnader mellan däggdjur och fåglar immunförsvaret själva bidrar skillnader i fylogenetiska utvecklingen i dessa två djur klasser för att de olika Ab särdrag. Flera författare har rapporterat att kycklingarna ofta producerar Abs mot fylogenetiskt starkt konservativa däggdjursproteiner eller peptider mer effektivt än vad kaniner (för granskning se Schade et a. 2005). Som en konsekvens kan en bevarad antigen vara "maskerad" till kaninen immunförsvaret, och därmed orsaka bara en svag eller en "tyst" svar. Dessutom, om höns och kaniner immuniserade med samma däggdjur antigen, ofta kycklingarna svarar med en Ab-specificitet som sällan kan uppnås på kaniner. Även aspekten av djurskydd är viktigt eftersom Ab är icke-invasivt utvinns från äggula. I kombination med Gene-Gun (plasmid) immunisering av IgY-produktion är helt icke-invasiv (Witkowski et al. 2009).
Sammanfattningsvis är produktionen av Ab höns och IgY-extraktion med hjälp av PEG-fällning mycket kostnadseffektiv och resulterar i mycket specifika Ab med stabil titrar upp till 1:1,000,000. På grund av det fylogenetiska avstånd mellan Aves och Mammalia, kyckling kan tillverka specifika AB mot starkt konservativa däggdjur antigener i motsats till t ex kaniner. Den extra mängd Ab erhålls genom IgY-tekniken öppnar dörren också för att använda IgY-Ab i human-och veterinärmedicin i terapeutiskt / profylaktiskt syfte.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av ett bidrag från det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (Project BiGRUDI [Bi ologische G efahrenlagen: R isikobewertung, u ltraschnelle D etektion und jag dentifizierung von bioterroristisch relevanten Agenzien, 13N9594]). Vi tackar B. Diemar (Charité-Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie) för utmärkt tekniskt bistånd.