Vi presentiamo due indipendenti, microscopio a base di strumenti per misurare le deformazioni indotte nucleare e del citoscheletro in camere singole, cellule viventi aderenti in risposta alla applicazione dello sforzo globale o localizzato. Queste tecniche vengono utilizzate per determinare la rigidità nucleare (cioè, deformabilità) e di sondare la trasmissione intracellulare vigore tra il nucleo e il citoscheletro.
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Articolo metodologico
Saggi biofisici per sondare le proprietà meccaniche del nucleo della cellula Interphase: Strain supporto Applicazione e manipolazione microago
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nella maggior parte delle cellule eucariotiche, il nucleo è l'organello più grande ed è tipicamente 2 a 10 volte più rigido del citoscheletro circostante, di conseguenza, le proprietà fisiche del nucleo contribuire in modo significativo il comportamento generale biomeccanico delle cellule in condizioni fisiologiche e patologiche. Per esempio, nella migrazione dei neutrofili ed invadere le cellule tumorali, rigidità nucleare può rappresentare un grosso ostacolo durante stravaso o il passaggio attraverso spazi ristretti all'interno dei tessuti 1. D'altra parte, il nucleo delle cellule nei tessuti meccanicamente attivi come muscolare richiede un adeguato sostegno strutturale resistere alle ripetute sollecitazioni meccaniche. È importante sottolineare che il nucleo è strettamente integrato nell'architettura di cellulari, ma è fisicamente collegato al citoscheletro circostante, che è un requisito fondamentale per il movimento intracellulare e il posizionamento del nucleo, per esempio, in cellule polarizzate, nuclei sinaptica a giunzioni neuromuscolari, o nella migrazione delle cellule. 2 Non sorprendentemente, mutazioni nelle proteine dell'involucro nucleare, come lamine e nesprins, che svolgono un ruolo critico nel determinare la rigidità nucleare e nucleo-citoscheletro accoppiamento, hanno dimostrato di recente per portare a una serie di malattie umane, tra cui Emery- Dreifuss distrofia muscolare, distrofia dei cingoli distrofia muscolare e cardiomiopatia dilatativa. 3 Per studiare la funzione di biofisica delle diverse proteine dell'involucro nucleare e l'effetto di mutazioni specifiche, abbiamo sviluppato metodi sperimentali per studiare le proprietà fisiche del nucleo in camere singole, le cellule viventi sottoposti a globale o localizzata perturbazione meccanica. Misura delle deformazioni indotte nucleari in risposta alla domanda di supporto proprio applicata ceppo rendimenti importanti informazioni sulla deformabilità del nucleo e permette di confronto quantitativo tra le diverse mutazioni o linee cellulari deficienti per specifiche proteine dell'involucro nucleare. Localizzata applicazione dello sforzo del citoscheletro con un microago viene utilizzato per integrare il dosaggio e può fornire ulteriori informazioni sulla trasmissione della forza intracellulare tra il nucleo e il citoscheletro. Studiare meccanica nucleare nelle cellule viventi conserva intatte l'architettura normale intracellulare ed evita artefatti potenziali che possono sorgere quando si lavora con nuclei isolati. Inoltre, lo sforzo di applicazione substrato presenta un buon modello per lo stress fisiologico sperimentato da cellule muscolari o di altri tessuti (per esempio, cellule muscolari lisce vascolari esposti al ceppo nave). Infine, mentre questi strumenti sono stati sviluppati principalmente per studiare la meccanica nucleare, possono anche essere applicato per studiare la funzione delle proteine del citoscheletro e di segnalazione meccanotrasduzione.
Protocollo
1. Substrato ceppo applicazione
La misurazione della pressione normalizzata nucleare comprende la preparazione di piatti tensioni con trasparente, membrane di silicone elastico come superficie di coltura cellulare di cellule placcatura sulle stoviglie, e l'acquisizione delle immagini delle cellule prima, durante e dopo (uniassiale o biassiale) applicazione dello sforzo.
Preparazione di piatti membrana di silicone e l'aderenza delle cellule
- Ogni piatto è costituito da un ceppo su misura piatto fondo di plastica con un diametro di 3 "e un O-ring in plastica per tenere una membrana di silicone, che funge ....
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Discussione
Substrato ceppo test
Applicazione ceppo è stato utilizzato con successo da noi e altri gruppi per lo studio delle deformazioni indotte nucleare in cellule sottoposte a stress meccanici e di indagare l'apporto di specifiche proteine dell'involucro nucleare alla rigidità nucleare. 4-8 Il vantaggio di questa tecnica è che le sonde proprietà meccaniche nuclei di vivere nel loro ambiente normale cellulare e del citoscheletro e che l'applicazione dello sforzo substrato assomi.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (R01 e R01 HL082792 NS059348) e il Brigham and Women Hospital Cardiovascolare Award Leadership Group.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | |
| Fibronectina | Millipore | FC010 | |
| MitoTracker FM Rosso e Verde FM | Invitrogen | M22425 e M-7514 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Sale di Hank Buffered Saline | Invitrogen | 14185 | |
| Fenolo libero, DMEM | Invitrogen | 21063 | |
| Siero fetale bovino | Aleken Biologicals | FBSS500 | |
| Penicillina / streptomicina | Sigma | P0781-100ML | |
| Vetro borosilicato con filamento | Sutter strumento | BF100-78-10 | |
| Lucido / lucido non armato fogli di silicone, 0.005 " | Specialità Manufacturing Inc. | ||
| Fosfato Dulbecco Buffered Saline | Invitrogen | 14200 | |
| 35 millimetri dal fondo di vetro piatti cultura (FluoroDish) | Mondo Strumenti di precisione, INC | FD35-100 | |
| Braycote 804 vuoto Grasso | Spi rifornimenti | 05133A-AB |
Riferimenti
- Friedl, P., Wolf, K., Lammerding, J. Nuclear mechanics during cell migration. Curr Opin Cell Biol. 23, 55-64 (2011).
- Mejat, A., Misteli, T. LINC complexes in health and disease. Nucleus. 1, 40-52 (2010).
- Worman, H. J., Fong, L. G., Muchir, A., Young, S. G.
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Ristampe e permessi
