संयंत्र पत्तियां में histone संशोधन की जांच
Summary
विशिष्ट पौधों के जीन पर histone संशोधनों का पता लगाने के लिए एक विश्वसनीय और उपयोगी दृष्टिकोण वर्णित है. दृष्टिकोण chromatin immunoprecipitation (चिप) और वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर को जोड़ती है. यह विभिन्न शारीरिक प्रक्रियाओं में एक भूमिका के साथ विशिष्ट जीन पर histone संशोधनों का पता लगाने की अनुमति देता है.
Abstract
Chromatin संरचना eukaryotes में जीन अभिव्यक्ति के नियमन के लिए महत्वपूर्ण है. इस प्रक्रिया में, histones H3 H4 और एमिनो टर्मिनल पूंछ पर chromatin remodeling, डीएनए मेथिलिकरण, और सहसंयोजक संशोधनों के आवश्यक भूमिका 1-2 निभाते हैं . H3 और H4 histone संशोधनों lysine और arginine मेथिलिकरण, lysine का एसिटिलीकरण, और सेरीन 1-2 अवशेषों की phosphorylation शामिल हैं. इन संशोधनों या तो जीन सक्रियण, दमन, या जीन कि अभिव्यक्ति की उचित (सूक्ष्म जीव जुड़े आणविक पैटर्न, प्रकाश, हार्मोन, आदि) संकेतों 3-7 की धारणा के बाद अधिक तेजी से और मजबूत सक्रियण का समर्थन करता है की एक primed राज्य के साथ जुड़े रहे हैं.
यहाँ, हम चयनित संयंत्र जीन पर विशिष्ट chromatin संशोधनों के विश्वसनीय और संवेदनशील पता लगाने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं. (संशोधित) 8,9 formaldehyde, निष्कर्षण और संशोधन विशिष्ट 9,10 एंटीबॉडी के साथ chromatin, chromatin immunoprecipitation (चिप) के sonication के साथ histones और डीएनए के crosslinking तकनीक पर आधारित है, histone – डीएनए परिसरों के डी – crosslinking , और जीन विशिष्ट वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर. दृष्टिकोण विशिष्ट histone 5,11 मक्का में 4 सी संश्लेषण और 3 Arabidopsis में प्रणालीगत रोगक्षमता के साथ जुड़े संशोधनों का पता लगाने के लिए उपयोगी साबित हो गया है.
Protocol
Discussion
प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम डीएनए और histones, पत्ता सामग्री के प्रकार और मात्रा के crosslinking हैं, सामग्री के पीस, और chromatin के sonication. इन मुद्दों के एक अधिक विस्तृत चर्चा के लिए, refs देखें. 9 और 10.
Sonication और crosslinking:
यह महत्वपूर्ण है 400bp के बारे में टुकड़े करने के लिए sonication के दौरान chromatin बाधित. संपूर्ण sonication डीएनए और histones में खलल न डालें द्वारा chromatin नष्ट, जबकि अपर्याप्त sonication लंबी chromatin टुकड़े छोड़ जाएगा. ये विधि की विशिष्टता को प्रभावित है, क्योंकि परीक्षण बिन्दुपथ से बाहर का histone संशोधनों स्थानीय संशोधनों से भेदभाव नहीं कर सकते हैं. Sonication दक्षता सर्वश्रेष्ठ 20μL chromatin एकत्रित नमूनों से पहले और बाद sonication, डीएनए डे crosslinking और histones, डीएनए अलग और agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा sheared डीएनए की लंबाई निर्धारित करने के द्वारा परीक्षण किया है. RNase वैद्युतकणसंचलन पहले नमूने के लिए जोड़ा जाना चाहिए, क्योंकि chromatin तैयारी शुद्धि है कि खंडित डीएनए के दृश्य के साथ हस्तक्षेप कर सकता है की इस स्तर पर अभी भी शाही सेना की बड़ी मात्रा में होता है है. नमूने chromatin immunoprecipitation के लिए उपयोगी होते हैं यदि गैर – sheared chromatin से डीएनए 10kbp से अधिक लंबी है, जबकि sheared chromatin से डीएनए डीएनए के 400bp आसपास अधिकतम संकेत तीव्रता के साथ एक धब्बा रूपों है.
हम नियमित रूप से बरकरार पत्तियों में chromatin crosslinking के लिए तीन (v / v)% formaldehyde उपयोग करते हैं, लेकिन एक (v / v)% formaldehyde के ज्यादातर मामलों में पर्याप्त हो सकता है. हमारे हाथ में, कम formaldehyde सांद्रता कम sonication और समय फलस्वरूप पीसीआर प्रतिक्रियाओं में पृष्ठभूमि संकेतों के लिए अनुमति देते हैं. हालांकि, formaldehyde के अपर्याप्त मात्रा में अक्सर स्वतंत्र प्रयोगों के बीच पीसीआर संकेत के कम reproducibility में परिणाम. यह सांद्रता कम formaldehyde के साथ पत्तियों के अपर्याप्त पैठ की वजह से हो सकता है. अपने formaldehyde के शेयर अक्सर मुद्रा के रूप में मिश्रित करने के लिए समय के साथ भाजन करना आदत सुनिश्चित करें. Formaldehyde समाधान केवल लगभग एक महीने के लिए स्थिर रहे हैं, और इस अवधि शायद ही मेथनॉल स्थिरीकरण द्वारा लंबे समय तक है. यह जब प्रयोगात्मक शर्तों की स्थापना के लिए अलग formaldehyde सांद्रता का परीक्षण करने की सलाह दी है.
संयंत्र सामग्री की राशि और पीस:
यह महत्वपूर्ण है बफर की एक बड़ी मात्रा में पत्ता सामग्री की कम मात्रा में घुसपैठ करने के लिए एक दूसरे से चिपके हुए पत्ते से बचने. पत्ता चिपका formaldehyde के अपर्याप्त घुसपैठ में अक्सर परिणाम. इसके अलावा, बहुत ज्यादा संयंत्र सामग्री miracloth ऊतक के pores ब्लॉक जाएगा. पीस दक्षता और सही फिट के साथ एक मोर्टार और मूसल के प्रयोग पर काफी निर्भर करता है. हम नियमित रूप से एक तरल नाइट्रोजन ठंडा और अतिरिक्त तरल नाइट्रोजन के अभाव में मूसल और मोर्टार के साथ 50 सेकंड के लिए तीन बार जब तक सामग्री एक ठीक पाउडर के लिए जमीन है. पीसने
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम जर्मन विज्ञान फाउंडेशन (DFG) और जर्मन संघीय और राज्य सरकारों की उत्कृष्टता पहल द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Protein-A-Agarose | Roche | 11 134 515 001 | depends on the antibody class |
| Protein-G-Agarose | Roche | 11 243 233 001 | depends on the antibody class |
| Anti-hyperacetyl-H4 | Millipore | 06-946 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K5 | Millipore | 07-327 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K8 | Millipore | 07-328 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K12 | Millipore | 07-595 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K16 | Millipore | 07-329 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K18 | Millipore | 07-354 | we used 1μL |
| Anti-acetyl-H3K9 | Millipore | 07-352 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H3K14 | Millipore | 07-353 | we used 1μL |
| Anti-trimethyl-H3K4 | Diagenode | pAB-003-50 | we used 5μL |
| Anti-dimethyl-H3K4 | Millipore | 07-030 | we used 5μL |
| Anti-monomethyl-H3K4 | Abcam | ab8895 | 2,5 -10μL |
| Anti-H3 | Abcam | ab1791 | we used 1μL to check histone density |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 TO | |
| Sonotrode MS72 | Bandelin | ||
| Miracloth | Calbiochem | 475855 | |
| Complete Protease Inhibitor | Roche | 11836145001 |
Riferimenti
- Eberharter, A., Becker, P. B. Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin. EMBO rep. 3, 224-229 (2002).
- Ruthenburg, A. J. Methylation of lysine 4 on histone H3: intricacy of writing and reading a single epigenetic. 25, 15-30 (2007).
- Jaskiewicz, M. Chromatin modification acts as a memory for systemic acquired resistance in the plant stress response. EMBO rep. 12, 50-55 (2011).
- Ng, D. W. Ordered histone modifications are associated with transcriptional poising and activation of the phaseolin promoter. Plant Cell. 18, 119-132 (2006).
- Offermann, S. Illumination is necessary and sufficient to induce histone acetylation independent of transcriptional activity at the C4-specific phosphoenolpyruvate carboxylase promoter in maize. Plant Physiol. 141, 1078-1088 (2006).
- Deng, W. Involvement of the histone acetyltransferase AtHAC1 in the regulation of flowering time via repression of FLOWERING LOCUS C in Arabidopsis. Plant Physiol. 143, 1660-1668 (2007).
- Benhamed, M. Arabidopsis GCN5, HD1, and TAF1/HAF2 interact to regulate histone acetylation required for light-responsive gene expression. Plant Cell. 18, 2893-2903 (2006).
- Bowler, C. Chromatin techniques for plant cells. Plant Journal. 39, 776-789 (2004).
- Orlando, V. Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde decrosslinked-chromatin immunoprecipitation. Trends Biochem. Sci. 25, 99-104 (2000).
- Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Meth. 3, 11-11 (2007).
- Danker, T. Developmental information but not promoter activity controls the methylation state of histone H3 lysine 4 on two photosynthetic genes in maize. Plant J. 53, 465-474 (2008).
- Uknes, S. Acquired resistance in Arabidopsis. Plant Cell. 4, 645-656 (1992).
- Workman, J. L. Nucleosome displacement in transcription. Genes Develop. 20, 2009-2017 (2006).
