डीएनए की फिंगरप्रिंटिंग माइकोबैक्टीरियम leprae चर संख्या मिलकर दोहराएँ (VNTR) का प्रयोग खींच
Summary
कुष्ठ, की वजह से<em> माइकोबैक्टीरियम leprae</em> अभी भी कई स्थानों में स्थानिकमारी वाले है. आदेश में कुष्ठ रोग के संचरण के प्रसार और मोड के बारे में जानने के लिए, यह महत्वपूर्ण है निर्धारित करने के लिए तनाव जो की<em> एम. leprae</em> एक मरीज संक्रमित है. अग्रानुक्रम दोहराता की परिवर्तनीय संख्या (VNTR) लिखकर एक ऐसी विधि है.
Abstract
The study of the transmission of leprosy is particularly difficult since the causative agent, Mycobacterium leprae, cannot be cultured in the laboratory. The only sources of the bacteria are leprosy patients, and experimentally infected armadillos and nude mice. Thus, many of the methods used in modern epidemiology are not available for the study of leprosy. Despite an extensive global drug treatment program for leprosy implemented by the WHO1, leprosy remains endemic in many countries with approximately 250,000 new cases each year.2 The entire M. leprae genome has been mapped3,4 and many loci have been identified that have repeated segments of 2 or more base pairs (called micro- and minisatellites).5 Clinical strains of M. leprae may vary in the number of tandem repeated segments (short tandem repeats, STR) at many of these loci.5,6,7 Variable number tandem repeat (VNTR)5 analysis has been used to distinguish different strains of the leprosy bacilli. Some of the loci appear to be more stable than others, showing less variation in repeat numbers, while others seem to change more rapidly, sometimes in the same patient. While the variability of certain VNTRs has brought up questions regarding their suitability for strain typing7,8,9, the emerging data suggest that analyzing multiple loci, which are diverse in their stability, can be used as a valuable epidemiological tool. Multiple locus VNTR analysis (MLVA)10 has been used to study leprosy evolution and transmission in several countries including China11,12, Malawi8, the Philippines10,13, and Brazil14. MLVA involves multiple steps. First, bacterial DNA is extracted along with host tissue DNA from clinical biopsies or slit skin smears (SSS).10 The desired loci are then amplified from the extracted DNA via polymerase chain reaction (PCR). Fluorescently-labeled primers for 4-5 different loci are used per reaction, with 18 loci being amplified in a total of four reactions.10 The PCR products may be subjected to agarose gel electrophoresis to verify the presence of the desired DNA segments, and then submitted for fluorescent fragment length analysis (FLA) using capillary electrophoresis. DNA from armadillo passaged bacteria with a known number of repeat copies for each locus is used as a positive control. The FLA chromatograms are then examined using Peak Scanner software and fragment length is converted to number of VNTR copies (allele). Finally, the VNTR haplotypes are analyzed for patterns, and when combined with patient clinical data can be used to track distribution of strain types.
Protocol
Discussion
कुष्ठ रोगियों से त्वचा के नमूनों का संग्रह कुशल चिकित्सकों या त्वचा क्लीनिक में काम कर रहे तकनीशियनों की आवश्यकता है. प्रयोगशाला इन नमूनों से निपटने श्रमिकों प्रयोगशाला कोट, दस्ताने और सुरक्षात्मक आँख पहनने पहनते हैं और एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में काम जब armadillo या ऊतक मानव के संक्रमित नमूनों से निपटने के लिए महान ख्याल रखना चाहिए. सतहों और उपकरणों की कीटाणुशोधन भी महत्वपूर्ण है. एक स्वच्छ, बाँझ जैव सुरक्षित कैबिनेट में कार्य डीएनए नमूनों के संक्रमण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है.
डीएनए निष्कर्षण Qiagen जैसी कंपनियों से निकासी किट के विकास के लिए अपेक्षाकृत आसान धन्यवाद बन गया है. निर्देशों का सावधानी से पालन किया जाना चाहिए. सभी नमूनों ठंडा रखा जाना चाहिए जब उपयोग में नहीं है. दोहराया, नमूने के लिए अत्यधिक तापमान परिवर्तन से बचें.
इस काम में इस्तेमाल किया डीएनए प्राइमरों विभिन्न कंपनियों जो इस पत्र के अंत में साहित्य के संदर्भ की सूची में उद्धृत किया गया है से आदेश दिया जा सकता है. देखभाल के लिए एक डीएनए मुक्त वातावरण में प्राइमरों के साथ काम करने में संक्रमण से बचने के लिए लिया जाना चाहिए. प्राइमर्स शुष्क पाउडर के रूप में आते हैं और ते के साथ मिश्रित किया जाना चाहिए और एक 100μM एकाग्रता के लिए पतला है, तो छोटी मात्रा (2a चित्रा ) में विभाजित है. प्राइमरों के कार्य समाधान आगे 10μM सांद्रता को पतला कर रहे हैं. फिर, डीएनए नमूने क्षेत्रों / डाकू जहां प्राइमरों इस्तेमाल किया और तैयार में प्रयोग नहीं करते.
पीसीआर उत्पादों को भी नहीं जब उपयोग में ठंडा रखा जाना चाहिए.
एक 3% agarose जेल तैयारी बेहतर डीएनए बैंड जुदाई दे, लेकिन अब लगता है को चलाने के लिए. विशुद्ध रूप से गुणात्मक प्रयोजनों के लिए, 2% आमतौर पर पर्याप्त है. Ethidium ब्रोमाइड agarose जैल में डीएनए को धुंधला करने के लिए इस्तेमाल किया समाधान है कि त्वचा के माध्यम से अवशोषित है एक अत्यधिक सक्रिय genotoxin है. इस समाधान है और यह महान देखभाल का उपयोग कर और हमेशा दस्ताने पहनना सुनिश्चित किया जा रहा के साथ दाग जैल संभाल. किसी भी डीएनए नमूने या ethidium ब्रोमाइड सामग्री से निपटने के बाद हाथ अच्छी तरह धो लें. Ethidium ब्रोमाइड धुंधला समाधान के निपटान धोने और संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार जैल. जैल नियमित की आवश्यकता नहीं कर रहे हैं, यह कदम एक बार FLA तरीकों को स्थापित किया गया है समाप्त किया जा सकता है. यह समय और अभिकर्मक लेने है.
formamide FLA के लिए नमूने की तैयारी में इस्तेमाल किया समाधान भी बेहद जहरीला है और देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए. इसके उपयोग के बाद हाथ धो लें. संस्थागत दिशा निर्देशों का पालन यह निपटाने की.
FLA के परिणाम पीक स्कैनर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर पढ़ना चुनौतीपूर्ण हो सकता है है . एलील कॉल (अग्रानुक्रम दोहराता की संख्या) का एक बुनियादी सेट CSU (07/04 टेबल्स) में विकसित किया गया है. (यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि 4-7 टेबल्स सभी समावेशी नहीं हो सकता है. एम. के अन्य उपभेदों के रूप में leprae अध्ययन कर रहे हैं, प्रतिलिपि संख्या के साथ सूचीबद्ध पर्वतमाला के बाहर alleles पाया जा सकता है.) एक विशेष चुनौती 'हकलाना' चोटियों शामिल है. इन चोटियों के STRs है कि केवल (टीए) जैसे 10 2-3 आधार जोड़ी को दोहराता है, शामिल, विशेष रूप से परिवारों रहे हैं. कभी कभी सही चोटी का चयन पढ़ने के लिए मुश्किल है (चित्रा 7 ). यह आंकड़ा 190 बीपी पर सकारात्मक नियंत्रण में चरम मुख्य शिखर है. ऊंचाई में कम चोटियों, कि 2 हैं 4, या यहाँ तक कि 6 बेस जोड़े के रूप में बड़े या मुख्य चोटी की तुलना में छोटे 'हकलाना चोटियों.' कहा जाता है एक पीछा भी भ्रम की स्थिति पैदा कर सकते हैं. एक पीछा पहले पाठ में और चित्रा 8 में वर्णित है. अंत में, यदि पीसीआर उत्पादों को उच्च नमूनों में प्रचुर मात्रा में हैं, चोटियों एक डबल कील के साथ प्रकट हो सकता है. इस मामले में चोटी के फार्म का केंद्र पढें. (चित्रा 6, 6 रोगी देखें.)
डेटा प्रबंधन काम के इस प्रकार के लिए एक दुर्जेय कार्य किया जा सकता है. यह महत्वपूर्ण है जैसे सभी प्रयोगों के लिए सभी प्रासंगिक जानकारी के रिकॉर्ड के लिए: एक कार्य या प्रक्रिया की तारीख, ऑपरेटर, पट्टी / प्लेट नक्शे, FLA आदेश, पीसीआर स्थितियों और व्यंजनों, जैल और तस्वीरों के दिनांक, भंडारण तापमान, डीएनए टेम्पलेट dilutions, FLA इलेक्ट्रॉनिक फ़ाइल का भंडारण स्थानों, आदि अच्छा संगठन और डेटा प्रबंधन समय के घंटों को बचाने के लिए भविष्य में जानकारी के विशिष्ट टुकड़े के लिए देख खर्च कर सकते हैं.
यहाँ वर्णित प्रयोगशाला कई वर्षों के लिए काम किया गया है पर कोलोराडो राज्य विश्वविद्यालय में और दुनिया भर के अन्य स्थानों पर जा रहा है. एकत्र आंकड़ों के सब क्या मतलब है और यह भविष्य के उपयोग के के कैसे हो सकता है की एक बड़ी तस्वीर उभरने लगा है. आंकड़े 10A और 10B प्रदर्शन कैसे इन डीएनए उंगलियों के निशान अलग एम. भेद किया जा सकता (10A) देशों के बीच या भी परिवारों (10B) के बीच leprae उपभेदों . परिवार और सामुदायिक मामलों लिंक्ड एम. ले दिखाया गया है leprae समान या समान VNTR तनाव प्रकार की. आशा है कि यह संभव हो ताकि संचरण नेटवर्क का एक प्रारंभिक पहचान प्रणाली उन लोगों को राज्यमंत्री के लिए विकसित किया जा सकता है कुष्ठ रोग के संचरण के मोड (ओं) में आगे अंतर्दृष्टि लाभ हो सकता हैजोखिम है, और है कि उपचारात्मक ड्रग थेरेपी पर टी स्थायी तंत्रिका विज्ञान और dermatological नुकसान किया है से पहले शुरू कर सकते हैं.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अनुदान NIH / NIAID RO1 – ऐ – 63,457 अनुदान और ARRA अनुदान S1 RO1 – ऐ – 63,457 पूरक द्वारा प्रदान की गई थी. हम प्रयोगशाला समूह और सहयोगियों के सभी वर्तमान और अतीत के सदस्यों के योगदान को स्वीकार करते हैं.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| DNeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| Multiplex PCR Kit | Qiagen | 206143 | |
| DNA Primers | Various | ||
| Agarose Gel | Various | ||
| 5x or 6x Gel Loading Buffer | New England Biolabs | B7021S | Recipes available to make your own* |
| Ethidium Bromide solution | Various | Dilute from con. | |
| Hi-Di Formamide Solution | Applied BioSystems | 4311320 | |
| Gene Scan -500 LIZ | Applied BioSystems | 4322682 |
* http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html
| Equipment | Comments |
|---|---|
| 2 Refrigerators | 4°C: 1 for DNA samples, 1 for primers and Multiplex reagents |
| 1 microwave oven | Or suitable way for heating agarose and water to make gels |
| 1 autoclave | Or pressure cooker for sterilizing materials |
| PCR machine | Thermocycler |
| 2 sets of pipettes | 0.5-10 μl, 10-100 μl, 20-200 μl, 1000 μl 1 set for primers, 1 set for DNA |
| Submarine gel electrophoresis box | With forms and combs for preparing gels. |
| Electrophoresis power supply | With cables for connection to gel box |
| Heat block | For Eppendorf tubes |
| Centrifuge | For Eppendorf tubes/strips |
| Capillary electrophoresis system (genetic analyzer) | Or access to an institution that can perform this analysis |
| Plastics | Disposable aerosol pipette tips, Eppendorf tubes, 8-well strips, 96-well plates, some of optical quality |
| Computer with Internet connection |
Riferimenti
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