תוכנית הניסוי שלנו הוא ניתח באופן סכמטי באיור 1. 1. צמיחה והכנת אדם בתאי גזע עצביים (NSCs) להשתלה EnStem-A קו תאים (EMD Millipore) שימש במחקר זה. NSCs מאומתים באופן שגרתי על ידי היצרן עבור רמות גבוהות של ביטוי של סמנים multipotent nestin ו Sox2, נמוכה רמת הביטוי של הסמן pluripotent אוקטובר-4, יחד עם היכולת להתמיין פנוטיפים נוירונים מרובים לשמור על קריוטיפ נורמלי אחרי מספר קטעים. בתנאים הצמיחה שלנו, NSCs אלה מוצגים ביטוי בשפע של Sox2 ו nestin ושמר את יכולתם להבדיל, כפי שתואר לעיל 1. NSCs גדלו על פולי-L-ornithine (20 מיקרוגרם / מ"ל) ו laminin (5 מיקרוגרם / מ"ל) בתרבית רקמה מצופה צלוחיות טיפול. תאים גודלו בינוני הרחבת עצביים (Millipore) בתוספת L-גלוטמין (2 מ"מ) פיברובלסטים בסיסיגורם הגדילה (bFGF: 20 ng / ml). Monolayers חסיד של NSCs היו passaged בכל יום אחר (01:02) עם accutase כסוכן דיסוציאציה 1. עבור מחקרים השתלה, NSCs שימשו במעברים מתחת ל -10. NSCs תויגו עם 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) על ידי השלמת אמצעי התקשורת צמיחה עם 4 מיקרומטר BrdU במשך שלושה ימים לפני ההשתלה. כדי לאמת את תיוג BrdU המדד (כלומר אחוז התאים BrdU חיובי), התאים היו מצופה בשקופיות קאמרית מעובד לגילוי BrdU באמצעות גישות immunocytochemical סטנדרטי. תאים להשתלה מנוצל באופן שגרתי התערוכה תיוג מדדי העולה על 90% 2. לחלופין, המושתלים בתאי גזע אנושיים התגלו באמצעות סמן אדם ספציפי לערמונית גרעיני (HuNu) 2. ביום ההשתלה, accutase התקשורת הרחבה עצביים היו טרום חימם אמבט מים 37 מעלות צלזיוס. תאים הושמו בינוני הדגירה (התרחבות התקשורת העצבית המכיל 10 מיקרומטרשל Y-27632) במשך שעה אחת. Y-27632 (רוק מעכב, EMD-Calbiochem) שימש כדי לשפר את ההישרדות של NSCs שלאחר ההשתלה. לאחר שעה, מדיה הדגירה הוסר תאים שטופלו accutase במשך 5 דקות. לאחר טיפול קצר זה להוסיף נפח שווה של התקשורת הרחבה עצביים כדי לנטרל את accutase ומתח התאים דרך מסננת תא 70 מיקרומטר. ספירת התאים עם haemocytometer ולהכין 1.0 x 10 5 NSCs לחיות לכל microliter במדיום הזרקה (התקשורת העצבית הרחבה המכיל 10 מיקרומטר של Y-27632, 40 ng / ml bFGF, 20 ng / ml BDNF). תאים אוחסנו אמצעי התקשורת הרחבה עצביים (כפי שמתואר 1.5) ושמרה על הקרח עד למועד ההשתלה, ויש להשתמש בהם תוך 6 שעות כדי למזער מוות של תאים על ידי ממושך הקירור. 2. רדיותרפיה – טיפול תכנון הקרנה עכברוש מסומם בעירום athymic (ים) הונחו בתוך סורק MRI מעבדה ב positio מועדים n עם הגולגולת בסוף מעולה (הראש הראשון). סורק זה 3 טסלה מיועד סריקות חיה קטנה. זה יכול לספק ניגודיות מעולה ברקמות הרכות עם מרחבית גבוהה חתך ברזולוציה (צירית) תמונות. הסריקה התמקדו באזור הגולגולת סט של 22 תמונות T2 E60 משוקלל בעובי 0.8 מ"מ תמונה נוצרו. דימויים אלו מספקים מידע נחוץ כדי לזהות את hippocampi ימינה ושמאלה בתוך המוח של חולדות. לאחר סריקת MRI (24 שעות), החיות היו מסומם [קוקטייל הרדמה (קטמין, 30 מ"ג / ק"ג, xylazine, 2.5 מ"ג / ק"ג ו acepromazine, 1 מ"ג / ק"ג)] והושמו סורק CT קרינה אונקולוגית שם אחר חתך (axial), נפח תמונת נוצר. החולדה הוצב זהה או קרוב למצב זהה המשמשים לסריקת MRI ו-CT היחידה הוקמה כדי לסרוק את האזור הגולגולת. מחקר של 106 תמונות CT עם עובי 0.8 מ"מ תמונת נוצר שהפך תכנון טיפול נתוני CT. תכנון הטיפולחה "> MRI ו-CT נתוני התמונה הועברו התוכנה Eclipse (וריאן מערכות רפואיות, פאלו אלטו, קליפורניה) תכנון טיפול באמצעות DICOM (Digital Imaging-ותקשורת ברפואה). Eclipse היא תוכנה מתוחכמת זמינים מסחרית בשימוש לאונקולוגיה למודל ועיצוב הטיפול הטוב ביותר עבור המטופל תוכנית קרינה. היא משלבת צפיפות איבר המידע מופק נתוני התמונה CT ו להשתמש כדי לחשב את מינון הקרינה הפצה בתוך הגוף. כסה את בעל החיים באמצעות וילון כירורגי קטן עם הראש רק חשוף. מקם את ראש החיה בחוזקה במסגרת stereotaxic (דיגיטלי בנצ'מרק, לייקה-myNeurolab) על ידי הוספת פסי האוזן לתוך meatus שמיעתי חיצוני. קח בזהירות רבה כאשר מחליק את קצה האוזן בר לתוך תעלת האוזן. מניחים את בר החותכת ידי משדלת החותכות העליונות של החולדה והתאמת גובה בר לנקודת ההתייחסות רגיל, ואז להדק מהדק את האף. במרכז עמדההראש בין הסורגים האוזן עם התנועה לרוחב מינימלי (± 4 מ"מ) כדי להשיג אפס stereotaxic. השלב הבא בתהליך הוא לקבוע את הטכניקה קרינה לשמש. טיפול קשת אינטנסיביות, מווסתת הקרנות (IMRT) ו-volumetrically מאופנן (VMAT) בצורה של RapidArc הם 2 דיוק גבוהה טכניקות הקרנה המשתמשות 6 MV פוטון הקורה כדי לספק קרינה במינון 3-6. ההבדל בין טכניקות אלה היא IMRT מספק מנה באמצעות מסלולי סטטי מספר אחד המתאים לכיוון אחר אבל מתכנסים בהיקף היעד מתאים יותר כרכים יעד מאוד קטן. RapidArc מצד שני, מספק מנה באופן דינמי באמצעות אחד או יותר קשתות התמקד באזור היעד (איור 4). ללא קשר לטכניקה הלידה, מידע על מינון היעד, בהתאם ליעד ואילוצים מנה לאיברים קריטיים צריכים להיות נכנס בחלון מנה אופטימיזציה של Eclipse. Tהמידע שלו, יחד עם כמויות איבר משמש כדי להתאים את המינון הפצה, אשר מושגת על ידי שינוי מתמיד הנחתה הקורה במהלך ההקרנה. לאחר תוכנית נוצר, Eclipse מספק את מינון מחושב על גבי, תמונות צירית העטרה ועל sagittal (איור 5), כמו גם בפורמט במינון נפח היסטוגרמה (DVH) (איור 6). זהו, בשלב זה, כאשר תוכנית יש להעריך כדי לקבוע אם הוא מתאים או משלוח צריך להיות משופר. תהליך הקרנה לאחר התוכנית אושרה למסירה, משוחזר דיגיטלית תצלום רנטגן (DRR) תמונות שנוצרו מן התכנון נתוני טיפול CT ב Eclipse. אלו הן תמונות אורתוגונליים משוקלל על צפיפות העצם כדי להדגיש את הגולגולת הגרמית ציוני דרך אחרים. לאחר מכן, תוכנית הטיפול DRRs נשלחים אל מערכת המסירה המחשב טיפול באמצעות DICOM. מערכת המסירה שולט הטרילוגיה וריאן לינארי Accelerator nהשתמשו ormally עבור הקרנות של בני אדם. מאיץ הוא מצויד 120 מבוקרת מחשב collimators multileaf דק (MLC) לבין איכות האבחון רנטגן מערכת הדמיה כלול בתוך המערכת ב-Board (OBI) הדמיה. זו מערכת המסירה אלבומים המידע ליקוי ספציפיים reconfigures הפרמטרים collimator ב דוושת הגז לאספקת המנה המתוכנן. בנקודה זו חולדה הוכן עבור הקרנה, תרופות הרגעה ו מכוסה בשמיכה נייר כדי לשמור אותו חם. אחרי כמה דקות, חולדה, עם שמיכה שלה אבל עם גולגולת חשופה, הונחה על שולחן הטיפולים באותה תנוחה השתמשו כדי ליצור את בדיקת CT. זהו שלב קריטי משום דיוק מיקום קשורה ישירות דיוק במשלוח מנה. לאחר עכברוש הוצב כראוי על שולחן הטיפולים, קבוצה של רנטגן תמונות אורתוגונליים נלקחת באמצעות מערכת OBI של הטרילוגיה. אלו הן תמונות ברזולוציה גבוהה שהיו התמזגו לאחר מכן ליצור ליקוי חמהDRRs ד באמצעות תוכנת איחוי OBI התמונה. רנטגן תמונות DRRs הותאמו דיגיטלית באמצעות תוכנה המספקים מידע על המיקום משמרות טבלה חייב להיעשות על מנת להשיג שיתוף אחת מהתמונות (איור 7). לאחר בחינת המידע הזה לאימות משמרות כתוצאה לא בשוגג להוביל לתוך כל מאיץ התנגשויות בין לשולחן טיפול, המחשב מחיל את משמרות את השולחן הטיפול נע באופן אוטומטי למיקום הרצוי. בנקודה זו, מתחילה הקרנה. כדי לספק מנה 10 Gy עם תוכנית 6-IMRT השדה, הקורה בזמן הוא כ 10 דקות בעוד שני קשת RapidArc לוקח ~ 3 דקות. לאחר הלידה הטיפול תושלם, החולדה הוצא מחדר הטיפול מותר להתאושש בכלוב מחזיק שמרה על כרית חימום. 3. ניתוח Stereotaxic להשתלה תוך בהיפוקמפוס בתאי גזע אנושיים nimals בעלי והכנת כירורגית במחקר זה, אנו העסיקה שני בן חודש ATN חולדות רכשה מן המכון הלאומי לסרטן (זן 0N01 Cr: NIH-rnu). החיות הוחזקו בכלובים סטריליים ומתוחזק בטמפרטורה ו-מחסום אור מבוקר בסביבה עם אור 12-h/12-h / מחזור כהה. חולדות סופקו מזון autoclaved ו כרצונך מים טיפול נלקח על מנת למנוע דלקת עיניים על ידי ניקוי העיניים בכל שבוע עם משחה עין Vetropolycin (אספקה מערבי רפואי, Arcadia, CA). לניתוח stereotaxic, החולדות היו מורדמים עם זריקה ip של קוקטייל הרדמה (קטמין, 30 מ"ג / ק"ג, xylazine, 2.5 מ"ג / ק"ג ו acepromazine, 1 מ"ג / ק"ג). הרדמה מלאה גובש לאחר 10-15 דקות הרגעה היה פיקוח באמצעות רפלקס מוחשית (קמצוץ הבוהן). אם נדרש במהלך הניתוח, 15-20% של המינון המקורי ניתן לתת כדי לשמור על הרדמה מספיק. הסרת הפרווה מהראש באמצעות קוצץ חשמלי. בערך200% משטח הניתוח צריך להיות מגולח כדי למנוע זיהום על ידי השערות. חלק מגולח נקי באמצעות providone / יוד (3 פעמים) ואחריו אלכוהול 70% (3 פעמים) לפני חיתוך. Stereotaxic ניתוח Stereotaxic מכשירים (דיגיטלית לפקח מסגרת), לקדוח micromotor, מעקר המיטה יבש בקרי יש לשמור ברדס זרימה למינרית כדי למנוע זיהום אפשרי במהלך ההליך ניתוח בחולדות ATN. בשלב stereotaxic עם כרית חימום מוטבע ניתן להשתמש כדי לשמור על החיות חם במהלך הניתוח. השתמשנו "קימברלי קלארק Safeskin סגול סטרילי Nitrile הבחינה כפפות" thoughout הניתוח. כפפות אלה ארוזים בנפרד בשקית סטרילית (לא קט. 55,093). בנוסף, מנתח בשימוש ספריי אלכוהול 70% לחטא את הידיים במהלך הניתוח. כסה את בעל החיים באמצעות וילון כירורגי קטן עם הראש רק חשוף. מקם את ראש החיה בחוזקה במסגרת stereotaxic (דיגיטלי בנצ'מרק, לייקה-myNeurolab) על ידי החדרת האוזן bars לתוך meatus השמיעה החיצונית. קח בזהירות רבה כאשר מחליק את קצה האוזן בר לתוך תעלת האוזן. מניחים את בר החותכת ידי משדלת החותכות העליונות של החולדה והתאמת גובה בר לנקודת ההתייחסות רגיל, ואז להדק מהדק את האף. מרכז את עמדתו של ראש בין הסורגים האוזן עם התנועה לרוחב מינימלי (± 4 מ"מ) כדי להשיג אפס stereotaxic. בעקבות הפעולות מיצוב, להחיל סיכה משחה העין כדי למנוע התייבשות ולהגן עליהם מפני יוד אפשרי או נשפך אלכוהול. השתמש במשחה לפחות 2 פעמים במהלך הניתוח. הפוך את החתך בעור קו האמצע (2 ס"מ) לאורך הקרקפת בעזרת אזמל סטרילי, נקי בעזרת צמר גפן סטרילי היטה המוליך. הימנע נזק הזנב ואת שרירי הצוואר אזורים. באמצעות מפשק לנתח, החזק periosteum הפתוח רקמות רכות באמצעות מטוש צמר גפן ברור שקצהו טבול חמצן 1% מימן (שנעשו PBS). כדי לעצור את הדימום, לשמור על לחץ חזק על mi לפחות 1n באמצעות צמר גפן או גזה היטה המוליך. החל בתנועה חברת גרידה כדי לנקות את הגולגולת בתנועה מספיגה לעור עד תפרים בגולגולת, היו גבחת ו למבדה גלוי. קואורדינטות stereotaxic מדויק, הפניה אל גבחת, היו נחושים להשתמש במוח חולדה אטלס 7. השתלת תא גזע נעשה בארבע לאתרים ייחודיים עבור כל חצי הכדור באמצעות קואורדינטות stereotaxic הבאים: Anterio-האחורי (AP) 3.0 מ"מ מ גבחת, מדיו, לרוחב (ML) 1.8mm מתוך קו האמצע ו-dorso הגחון (DV) 3.2mm מפני השטח של המוח. AP, 3.6 מ"מ; ML, 2.5 מ"מ; DV, 3.2 מ"מ AP, 4.2 מ"מ; ML, 3.2 מ"מ; DV, 3.2mm AP, 4.2 מ"מ; ML, 3.2 מ"מ; DV, 3.2mm לאחר גבחת זוהה, כל שלוש קואורדינטות (AP, ML ו DV) צריך להיות מאופס בבקר להציג / דיגיטלי (על מסגרת stereotaxic דיגיטלי). ואז להמשיך לסמן את אתרי השתלה מדויקת (באמצעות קואורדינטות האמור לעיל) עם עט סמן קנס נקודת מצורף מחזיק בדיקה קטנה על המסגרת. לקדוח חור 0.35mm (מס 'בר שיניים 1 / 4, חתיכות קרביד ונדיום לקדוח) דרך הגולגולת באמצעות דוושת רגל תרגיל מבוקר micromotor (לייקה-myNeurolab). תשמרי על עצמך כדי למנוע נזק קרום הדורה. אם הדימום מתרחש במהלך הקידוח, חברת להפעיל לחץ באמצעות מטוש צמר גפן מוטה. אין לשים אלכוהול או יוד באתר קידוח, כמו זה יגרום לגירוי החיה. החולדות קיבלו הבילטרליים התוך בהיפוקמפוס זריקות של השעיה של NSCs מוזרק בנפח מרבי של 1 μL באמצעות 5 μL microsyringe המילטון (30 מד). מספרם המדויק של תאים בתוך נפח זה ישתנה בהתאם פרטי הניסוי. כדי להשיג זאת, microsyringe היה מחובר למחזיק בדיקה קטנה על מסגרת stereotaxic. בזהירות להכניס את קצה המחט בגולגולת עד שהגיע לפני השטח של המוח (כלומר קרומי המוח). בשלב זה, את DV תיאוםte צריך להיות מאופס בבקר להציג / דיגיטלי, אז בעדינות להכניס את המחט עד לעומק הרצוי (DV, 3.2 מ"מ). המתן 1 דקות לפני ביצוע כל הזרקה של תאים. להזריק 0.25 נפח μL / min (שחרור איטי) באמצעות טיימר. לאחר סך של μL 1 מוזרק, לחכות 8 דקות לפני מחט retracting מאתר ההשתלה. לאחר תקופה זו, לאט לחזור המחט מאתר השתלה (0.5 mm / min) כדי למנוע נימי ריפלוקס של תוכן הזרקת בחזרה דרך מסלול המחט. בצע את שלבים 3.2 (jk) עבור אתרי השתלת הנותרים (4 בכל חצי הכדור). הסר את מפשק עור הגולגולת להשתמש בפינצטה בוטה למשוך את העור בעדינות נסוג לאחור להחיל 4-5 קליפים חלד סטרילי באמצעות Autoclips כירורגי תפר applier (לייקה-myNeurolab). לאחר הסרת חיה מן המסגרת, להזריק עם משכך כאבים (Buprenorphin, 0.1 מ"ג / ק"ג, sc, כל 12 שעות) ו Lactated הפתרון של רינגר (5 mL/250 עכברוש g למבוגרים, sc). הנח את גב חיה בכלוב שלה כי יש לשמור על כרית חימום. צג את החיה עד שהוא הופך מודע לפני החזרה לחדר אחזקותיה. מניחים כמה לחלח כדורי (חיה צ'או) ו transgel בצלחת פטרי נפרדות בתוך כלוב כל חיה. לחלופין, DietGel שחזור (ClearH 2 O, פורטלנד, ME) יכול לשמש כמקור של מים וחומרים מזינים. צג חיות בזמן התאוששות שלהם וליישם שיכוך כאבים (עצירות 0.02 מ"ג / ק"ג (כל 12 שעות עבור 2 ימים). בדוק סימנים של כאב, מצוקה, אדמומיות או זיהום של האתר הניתוח. החל providone / או משחה יוד וכוהל פעם ביום (עד 2 ימים -3) כדי למנוע זיהום אפשרי. אם סימני זיהום כאב, מצוקה או להתמיד בעקבות טיפול אנטיביוטי או משכך כאבים בתוך 12 שעות ניתוח, יש להתייעץ עם וטרינר או צוות טיפול בבעלי חיים לקבלת סיוע נוסף. 4. נציג תוצאות: iles/ftp_upload/3107/3107fig1.jpg "/> באיור 1. ייצוג סכמטי של תכנית הניסוי שלנו. באיור 2. Fusion של CT (אנטומיה גרמית) ו-MRI (רקמה רכה) תמונות בתוך התוכנה Eclipse. התאמת סעיפים צירית, העטרה, ועל sagittal לאפשר רישום משותף של תכונות אנטומיות קריטי במוח חולדה נגזר מודליות כל הדמיה. באיור 3. Contoured האזורים בהיפוקמפוס של המוח. לאחר היתוך התמונה, hippocampi והמוח למעט hippocampi מזוהים קווי מתאר axially הגדרת אזורים volumetric ספציפי איברים אלה. אזורים אלו מספקים מידע אנטומי נפח הדרושים עבור התאמת מינון הפצה ליעד הרצוי (ים). יור 4 "src =" / files/ftp_upload/3107/3107fig4.jpg "/> איור 4. גבוהה הקרנה דיוק אפשרויות באמצעות עוצמת-מווסתת הקרנות (IMRT) או volumetrically-מווסתת טיפול קשת (VMAT) בצורה של RapidArc. טכניקות אלו לספק 6 פוטון MV הקורות כמו גם מסלולי סטטי מרובים יכול להתכנס על כמויות יעד קטן מאוד (IMRT), או דינמי כמו אחת או יותר קשתות התמקד באזור היעד (RapidArc). איור 5. במינונים מחושבים על גבי Eclipse לתמונות צירית. מינון המוצגים הם עבור יחידה או כפולה hippocampi תוכניות טיפול הקרנה. איור 6. Eclipse מחושב המינון נפח ההיסטוגרמה. נתונים ניגודים אחוז מוקרן לעומת נפח שאינו מוקרן בהיפוקמפוס תחת hippoc את הסינגלתוכנית ampus טיפול באיור. 5. איור 7. עכברוש מודרך תמונה מיצוב עבור הקרנות. אורתוגונלית דיגיטלית משוחזר תצלום רנטגן (DRR) תמונות המופק התכנון נתוני CT טיפול בליקוי הם התמזגו רנטגן תמונות אורתוגונליים של החולדה על שולחן הטיפולים שצולמו ב-Board מערכת של הטרילוגיה (OBI) הדמיה. DRRs משוקללים על צפיפות העצם שמדגיש את הגולגולת הגרמית ציוני דרך אחרים המאפשרים שיתוף אחת עם תמונות OBI. התאמה של מערכות אלה לספק שולחן הטיפול עמדה משמרות כי חייב להיעשות כדי להשיג את שיתוף רישום של CT ו רנטגן תמונות. איור 8. NSCs מיקום של המושתלים לאחר הניתוח stereotaxic. בשעה 1 חודשים לאחר ההשתלה, החיות היו perfused, המוח היו sectioneד ו מוכתם BrdU (כדי לזהות NSCs מושתלים) ומוכתמת דלפק עם hematoxylin. המסלול מחט (NT, הקו האדום), מציין את מסלול הזריקה כי שהופקדו NSCs באתר ההשתלה שחרור (Tr), ממש מתחת כפיס המוח (CC) ומעל CA1. NSCs המושתלים הראו הגירה נרחבת של Tr ברחבי ההיפוקמפוס מארח (gyrus משוננת, DG, hilus משוננת, ד"ה: CA1 ו CA3 תת תחומים: x4 הגדלה). סרגל קנה מידה, 200 מיקרומטר.
