Användning av en optisk fälla för studier av Host-patogen interaktioner för Dynamic levande cell imaging
Summary
En metod beskrivs för att individuellt välja, manipulera och bild lever patogener med en optisk fälla kopplad till en snurrande skiva mikroskop. Den optiska fällan ger tid och bekämpning av organismer och placerar dem i anslutning till värdceller. Fluorescensmikroskopi fångar dynamiska intercellulära interaktioner med minimal störning till celler.
Abstract
Dynamisk levande cell imaging möjliggör direkt visualisering av realtidsinformation interaktioner mellan celler i immunsystemet 1, 2, men har bristen på tid och kontroll mellan fagocytiska cellen och mikrob återges fokuserade observationer i den inledande interaktioner mellan värd reaktion på patogener svårt. Historiskt sett har intercellulär kontakta evenemang såsom fagocytos 3 har avbildats genom att blanda två celltyper, och sedan kontinuerligt skanna field-of-view för att hitta serendipitous intercellulära kontakter i rätt skede av interaktion. Den stokastiska karaktären av dessa händelser gör denna process tråkig, och det är svårt att observera tidiga eller hastiga händelser i cell-cell kontakt med denna metod. Denna metod måste man finna cell par som är på gränsen till kontakten och observera dem tills de fulländade sin kontakt, eller inte. För att lösa dessa begränsningar, vi använder optiska fällor som en icke-invasiva, icke-förstörande, men snabb och effektiv metod för att positionera celler i kultur.
Optisk fällor, eller optisk pincett, i allt högre grad används i biologisk forskning att fånga och fysiskt manipulera celler och andra micron stora partiklar i tre dimensioner 4. Strålningstryck observerades först och tillämpas på optisk pincett system i 1970 5, 6, och var först används för att styra biologiska prover i 1987 7. Sedan dess har optisk pincett mognat till en teknik för att undersöka olika biologiska fenomen 8-13.
Vi beskriver en metod 14 som förskott levande cell imaging genom att integrera en optisk fälla med spinning disk konfokalmikroskopi med temperatur och luftfuktighet för att ge utsökt rumsliga och tidsmässiga kontroll av sjukdomsalstrande organismer i en fysiologisk miljö för att underlätta samspel med värdceller, som bestäms av operatören. Live var patogena organismer som Candida albicans och Aspergillus fumigatus, som kan orsaka potentiellt dödliga, invasiva infektioner med nedsatt immunförsvar 15, 16 (t.ex. aids, kemoterapi och organtransplantation patienter), optiskt fångad med icke-förstörande laser intensitet och flyttade i anslutning till makrofager, vilket kan phagocytose patogenen. Hög upplösning, genomlysning och fluorescens-baserade filmer etablerade förmågan att observera tidiga händelserna fagocytos i levande celler. För att visa det breda tillämpbarhet i immunologi, var primära T-celler också fångade och manipulerat för att bilda synapser med anti-CD3 mikrosfärer in vivo och Time-lapse avbildning av synaps bildning erhölls också. Genom att tillhandahålla en metod att utöva fina rumsliga kontrollen av levande patogener med avseende på immunceller kan cellulära interaktioner fångas upp av fluorescensmikroskopi med minimal störning för att celler och kan ge kraftfulla inblick i tidig svar medfödd och adaptiv immunitet.
Protocol
Discussion
I detta arbete använder vi en optisk fälla för att fånga patogener med dimensioner mellan 3 ìm – 5 ìm. Även om patogener av intresse för vårt labb har normalt dessa dimensioner är den optiska pincett som beskrivs här flexibla för att fälla ett stort utbud av storlekar. I själva verket optiska fällor har använts för att fånga partiklar från enskilda atomer till celler cirka 10 mikrometer i diameter. Dessutom var denna optiska fällor system som kan fånga upp partiklar av olika former: sfäriska, ellip…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Massachusetts General Hospital Institutionen för medicin interna medel (JMT, MKM, MLC, JMV), National Institute of Biomedical Imaging och bioteknik bevilja T32EB006348 (CEC), Massachusetts General Hospital Center for Computational och integrativ biologi utvecklingsfonden och AI062773 ( RJH), AI062773 bidrag, DK83756 och Danmark 043.351 (RJX), NSF 0.643.745 (MJL), NIH R21CA133576 (MJL) och National Institute of Allergy och infektionssjukdomar (NIAID) av National Institutes of Health (NIH) AI057999 (JMV ). Vi tackar Nicholas C. Yoder för bra diskussioner, och Charles filtar (RPI, Inc.) för tekniskt stöd.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| A. fumigatus | Albino strain, B-5233/RGD12-8, gift from K.J. Kwon-Chung, NIH | ||
| C. albicans | SSY50-B mutant, gift from Eleftherios Mylonakis, MGH; SC5314 strain, gift from Gerald Fink, Whitehead Institute | ||
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A20006 | |
| dimethylformamide | Sigma | D4551 | |
| Fresh blood | Gift from R.J.W. Heath, MGH, HMS | ||
| Nikon inverted microscope | Nikon | Model Ti-E | |
| Trapping laser, ChromaLase | Blue Sky Research | CLAS-106-STF02-02 | |
| Fluorescence excitation laser | Coherent | Model Innova 70C | |
| Breadboards for trapping components | Thorlabs | MB1224, MB1218 | |
| Optical air table | Technical Manufacturing Corporation | ||
| Electronic shutter with pedal control | Uniblitz | Purchased from Vincent Associates, Rochester, NY | |
| Singlemode optical fiber | Oz Optics | PMJ-3S3S-1064-6 | |
| Fiber positioner | Thorlabs | PAF-X-5-C | |
| Fiber collimator | Oz Optics | HPUCO-23-1064-P-25AC | |
| Lenses for telescope | Thorlabs | AC254-150-B | Focal length of 150 mm |
| Translation stages (x, y, z) | Newport | M-461-XYZ | |
| IR dichroic mirror | Chroma | ET750-sp-2p8 | |
| Objective lens (100X) | Nikon | NA = 1.49, oil immersion, TIRF objective | |
| Confocal head | Yokogawa | CSU-XI | |
| Polarizer | Nikon | MEN51941 | |
| Wollaston prism | Nikon | MBH76190 | |
| EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| CCD camera (ORCA ER) | Hamamatsu | C4742-80-12AG | |
| Filter wheel | Ludl | 99A353 | |
| Filter wheel | Sutter | LB10-NWE | |
| Chambered coverglass | Lab-Tek/Nunc | 155409 | |
| Dynabeads | Invitrogen | 111-51D | Coated with anti-CD3 |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen/Gibco | 10313 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen/Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine | Invitrogen/Gibco | 25030-081 | |
| Fetal Bovine Serum (HyClone) | ThermoScientific | SH30071.03 |
Riferimenti
- Grakoui, A. The immunological synapse: A molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
- Monks, C. R. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis and comparative innate immunity: Learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).
- Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
- Ashkin, A. Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 4853-4860 (1997).
- Ashkin, A. Acceleration and trapping of particles by radiation pressure. Phys Rev Lett. 24, 156-159 (1970).
- Ashkin, A., Dziedzic, J. Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria Science. Nature. 235, 1517-1520 (1987).
- Khalil, A. S. Single M13 bacteriophage tethering and stretching. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 4892-4897 (2007).
- Khalil, A. S. Kinesin’s cover-neck bundle folds forward to generate force. Proc Natl Acad Sci USA.. 105, 19247-19252 (2008).
- Li, Z. Membrane tether formation from outer hair cells with optical tweezers. Biophys J. , 1386-1395 (2002).
- Kim, S. The αβ T cell receptor is an anisotropic mechanosensor. J Biol Chem. 284, 31028-31028 (2009).
- Mohanty, S., Mohanty, K., Gupta, P. Dynamics of interaction of RBC with optical tweezers. Opt. Express. 13, 4745-4751 (2005).
- Tam, J. Control and manipulation of pathogens with an optical trap for live cell imaging of intercellular interactions. PLoS One. 5, e15215-e15215 (2010).
- Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. Aspergillosis case-fatality rate: Systematic review of the literature. Clin Infect Dis.. 32, 358-366 (2001).
- Wey, S. B. Hospital-acquired candidemia – the attributable mortality and excess length of stay. Arch. Intern. Med. 148, 2642-2645 (1988).
