피하 Muscarinic Antagonists의 관리 및 마우스에 Levator Auris의 Longus 근육의 트리플 - Immunostaining
Summary
우리는 levator auris의 longus (랄) 젊은 성인 마우스의 근육을 muscarinic 신호의 억제제의 반복 관리와 wholemounts 년에 신경근육학 분기점의 후속 immunostaining (NMJs)에 대한 절차를 설명합니다. 랄 근육이 공개에 대해 고유한 장점이 있습니다<em> 생체내에</emNMJs에> 약리 효과.
Abstract
이러한 gastrocnemius 및 정강뼈 앞쪽에 같은 설치류 동물, 뒷다리의 사지 근육은 자주 포유 동물 NMJs의 형성 및 유지에 필수적인 신호의 생체내 약리 연구에 사용됩니다. 그러나, 피하 또는 근육 관리 후이 근육에 약물 침투가 종종 불완전하거나 고르지이며 많은 NMJs는 영향을받지 남아있을 수 있습니다. 이러한 미니 펌프와 같은 장치와 함께 체계적인 관리가 spatiotemporal 효과를 향상시킬 수 있지만,이 방법의 침략 자연 혼란함을 주죠 염증 반응 및 / 또는 직접 근육 손상을 일으킬 수 있습니다. 그것이 시간이 많이 걸리는 시리얼 sectioning 및 광범위한 immunostaining을 필요로하기 때문에 또한 뒷다리 근육에 NMJs 완벽하게 분석 도전이다.
마우스 랄은 목 dorsum에 피상적으로있는 근육의 얇은 평면 시트입니다. 이 기능은 날개를 이동하는 빠른 트위치 근육이다. 이것은 두개골의 정중선에서 발생한 각 날개의 연골 부분에 옆으로 확장 주동이의와 꼬리 부분을 포함하고 있습니다. 근육은 그것이 종료 stylomastoid 구멍을 같은 caudally 프로젝트 안면 신경의 한 분과로 제공됩니다. 우리와 다른 NMJs 및 근육에 약물의 생체내 효과의 단기 및 장기 모두의 조사에 대한 이점을 제공하는 편리 준비하는 랄 발견했다. 첫째, 그 표면 위치는 가벼운 마취 약품의 여러 지역의 애플 리케이션을 용이하게합니다. 둘째, 그 두께 (근육 섬유로부터 2-3 층)은 근육 내의 거의 모든 NMJs의 시각화 및 분석을 수 있습니다. 셋째, 그 innervation의 패턴과 함께 자사의 신경 손상으로 해부의 용이성은 체외 9,5에 보충 electrophysiological 분석이 이루어질 수 있습니다. 아마도 마지막으로, 그리고 가장 중요한, 작은 볼륨 적용 (~ 50μl)는 쉽게 전체 근육의 표면을 커버 약물에 모든 NMJs의 유니폼 및 장기 노출을 제공하고 체계적인 접근 1,8의 필요성을 없애줍니다.
Protocol
Discussion
여기서 제시하는 방법은 포유 동물 NMJs의 안정성과 유지 보수에 신호 subtype 특정 mAChR의 이전에 인식되지 않는 역할의 조사를 허용합니다. 이 방법은 또한 neurotrophic 요인과 약리 대리인의 효과를 테스트하기 위해 도움이 될 것입니다. 예를 들어, 저희 연구실은 Ciliary Neurotrophic 팩터 (CNTF)는 성인 생쥐의 거의 모든 랄 신경 터미널에서 돋아 elicited 것으로 나타났습니다 1 . 이 결과는 CA에서 돋아 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 근육질 영양 장애 협회, NIH (NS062320)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| ketamine | Hospira | NDC0409-2051-05 | Dose: 120mg/kg |
| xylazine | Lloyd Laboratories | LA33806 | Dose: 8mg/kg |
| atropine | Sigma-Aldrich | A0132 | (>98% purity); Dose: 0.2mg/kg – 20mg/kg |
| atropine | Voigt Global Distribution | AT105 | Pharmaceutical grade |
| Methoctramine | Sigma-Aldrich | M105 | Dose: 100 – 400M |
| 4-DAMP | Sigma-Aldrich | D142 | Dose: 2.5mg/kg |
| AFDX-116 | Tocris Bioscience | 1105 | 250M |
| AFDX-384 | Tocris Bioscience | 1345 | 50M – 500M |
| MT 7 | Peptides International | PMT-4340-s | 0.1M – 1M |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first by dissolving 10g/100mL de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| Sodium pentobarbitol | Virbac Animal Health | NDC-051311-050-01 | Dose: 390mg/kg |
| Sylgard | Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit, can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Use at concentration of 1:200 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Use at concentration of 1:1000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Use at concentration of 1:10 |
| S100 | Dako | Z0311 | Use at concentration of 1:400 |
| FITC- goat anti-mouse IgG1 | Roche | 03117731001 | Use at concentration of 1:200, but if background is high, try 1:400 |
| Alexa-Fluor 647 conjugated goat anti-rabbit | Invitrogen | A21244 | Use at concentration of 1:200 |
| Vectashield fluorescent mounting media | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set media, you will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 |
Riferimenti
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