Подкожного введения мускариновых антагонистов и Triple-Иммуноокрашивание из Лонг Levator Auris мышц у мышей
Summary
Мы описываем процедуры повторных доз ингибиторов мускариновых сигнализации на Лонг поднимающей Auris (LAL) мышцы молодых взрослых мышей и для последующего иммуноокрашивания его нервно-мышечного соединения (NMJs) в wholemounts. LAL мышц имеет уникальные преимущества для выявления<em> В естественных условиях</em> Фармакологического воздействия на NMJs.
Abstract
Задние мышцы конечностей грызунов, таких как икроножной и передней большеберцовой, которые часто используются для прижизненного фармакологические исследования сигналов необходимо для формирования и поддержания млекопитающих NMJs. Тем не менее, препарат проникновения в эти мышцы после подкожного или внутримышечного введения часто неполные или неодинаковым и многие NMJs может оставаться неизменным. Хотя системное введение с таких устройств, как мини-насосы могут улучшить пространственно-временных эффектов, инвазивный характер такого подхода может вызвать смешанные воспалительные реакции и / или прямой ущерб мышцы. Более того, полный анализ NMJs в мышцу задней конечности является сложной задачей, поскольку требует много времени последовательный секционирования и обширные иммунной окраски.
LAL мыши представляет собой тонкий, плоский лист мышца, расположенная поверхностно на тыльной поверхности шеи. Это быстро сокращающихся мышц, функции, чтобы перемещать ушной раковины. Он содержит ростральной и хвостовой части, которые происходят от средней линии черепа и тянутся по бокам к хрящевой части каждой ушной раковины. Мышцы поставляется ветви лицевого нерва, что проекты, каудально при выходе шилососцевидный отверстия. Мы и другие нашли LAL быть удобной подготовки, что дает преимущества для изучения как краткосрочных, так и долгосрочные в естественных условиях воздействия наркотиков на NMJs и мышц. Во-первых, его поверхностное расположение облегчает несколько локальных приложений наркотиков, находящихся под легкой анестезией. Во-вторых, своей худобой (2-3 слоев мышечных волокон) позволяет визуализации и анализа практически всех NMJs в мышцах. В-третьих, простота рассекает его с ее нетронутыми нервы вместе с образцом его иннервации позволяет дополнительного анализа электрофизиологических в пробирке 9,5. Последнее, возможно, самое главное, малый применяются объема (~ 50 мкл) легко покрывает всю поверхность мышц, обеспечивает равномерную и длительное воздействие всех его NMJs к препарату и устраняет необходимость в системном подходе 1,8.
Protocol
Discussion
Метод, представленный здесь позволяет исследовать ранее неизвестные роли подтипа конкретных mAChR сигнализации в стабильности и поддержание млекопитающих NMJs. Этот метод также будет полезна для проверки эффектов нейротрофических факторов и фармакологических агентов. Например, наши ла?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана мышечной дистрофии ассоциации, NIH (NS062320).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| ketamine | Hospira | NDC0409-2051-05 | Dose: 120mg/kg |
| xylazine | Lloyd Laboratories | LA33806 | Dose: 8mg/kg |
| atropine | Sigma-Aldrich | A0132 | (>98% purity); Dose: 0.2mg/kg – 20mg/kg |
| atropine | Voigt Global Distribution | AT105 | Pharmaceutical grade |
| Methoctramine | Sigma-Aldrich | M105 | Dose: 100 – 400M |
| 4-DAMP | Sigma-Aldrich | D142 | Dose: 2.5mg/kg |
| AFDX-116 | Tocris Bioscience | 1105 | 250M |
| AFDX-384 | Tocris Bioscience | 1345 | 50M – 500M |
| MT 7 | Peptides International | PMT-4340-s | 0.1M – 1M |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first by dissolving 10g/100mL de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| Sodium pentobarbitol | Virbac Animal Health | NDC-051311-050-01 | Dose: 390mg/kg |
| Sylgard | Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit, can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Use at concentration of 1:200 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Use at concentration of 1:1000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Use at concentration of 1:10 |
| S100 | Dako | Z0311 | Use at concentration of 1:400 |
| FITC- goat anti-mouse IgG1 | Roche | 03117731001 | Use at concentration of 1:200, but if background is high, try 1:400 |
| Alexa-Fluor 647 conjugated goat anti-rabbit | Invitrogen | A21244 | Use at concentration of 1:200 |
| Vectashield fluorescent mounting media | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set media, you will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 |
Riferimenti
- Wright, M. C., Son, Y. J. Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice. Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).
- Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).
- Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction. J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).
- Witzemann, V., Brenner, H. R., Sakmann, B. Neural factors regulate AChR subunit mRNAs at rat neuromuscular synapses. J Cell Biol. 114, 125-141 (1991).
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).
- Lanuza, M. A. Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase. C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).
- Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses. J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).
- Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin. J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).
- Wright, M. C. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
- Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors. J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).
- Dorje, F. Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes. J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).
- Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors. Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).
