Subkutan administrering av muskarina antagonister och Triple-immunfärgning av levator Auris longus muskel i Möss
Summary
Vi beskriver förfaranden för upprepad administrering av hämmare av muskarina signalerar till levator auris longus (LAL) muskler för unga vuxna möss och för efterföljande immunfärgning av neuromuskulära korsningar (NMJs) i wholemounts. Lal muskeln har unika fördelar för att avslöja<em> In vivo</em> Farmakologiska effekter på NMJs.
Abstract
Bakbenen muskler av gnagare, såsom gastrocnemius och tibialis anterior, används ofta för in vivo-farmakologiska studier av signaler viktiga för bildandet och underhållet av däggdjur NMJs. Det är dock drog inträngande i dessa muskler efter subkutan eller intramuskulär administrering ofta ofullständiga eller ojämn och många NMJs kan inte påverkas. Även systemisk behandling med enheter som mini-pumpar kan förbättra Spatiotemporal effekter, kan invasiv art detta tillvägagångssätt leda till felkällor inflammatoriska reaktioner och / eller direkt muskelskada. Dessutom är fullständig analys av NMJs i bakbenen muskel utmanande eftersom det kräver tidskrävande seriell sektionering och omfattande immunfärgning.
Musen LAL är en tunn, platt ark muskeln ligger ytligt på dorsum av halsen. Det är en snabbt muskelfibrerna som fungerar för att flytta ytterörat. Den innehåller rostralt och stjärtfenan delar som kommer från mittlinjen av kraniet och utöka sidled till brosk del av varje ytterörat. Muskeln tillhandahålls av en gren av ansiktsnerven att projekt caudally när det lämnar stylomastoid foramen. Vi och andra har funnit LAL vara en bekväm beredning som erbjuder fördelar för utredning av både kort-och långsiktiga in vivo effekter av läkemedel på NMJs och muskler. Först underlättar dess ytliga läge flera lokala tillämpningar av narkotika i lätt narkos. För det andra medger dess tunn (2-3 lager av muskelfibrer) visualisering och analys av nästan alla NMJs i muskeln. Tredje, tillåter enkel dissekera den med sitt Nerve intakt tillsammans med mönstret för sin innervation kompletterande elektrofysiologiska analys in vitro 9,5. Sist, och kanske viktigast, täcker en liten tillämpas volym (~ 50μl) enkelt hela muskeln yta, ger en enhetlig och långvarig exponering av alla dess NMJs på läkemedlet och eliminerar behovet av en systematisk strategi 1,8.
Protocol
Discussion
Den metod som presenteras här tillåter undersökning av tidigare okänd roller av subtyp-specifika mAChR signalering i stabilitets-och underhåll av däggdjur NMJs. Denna metod kommer också att vara användbar för att testa effekterna av neurotrofa faktorer och farmakologiska agenter. Till exempel, hittade vårt laboratorium som ciliär Neurotrophic Factor (CNTF) framkallade groning från nästan alla LAL nervändslut i vuxna möss 1 . Detta resultat jämförs med tidigare studier av CNTF behandlade bakbenen …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av muskeldystrofi Association, NIH (NS062320).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| ketamine | Hospira | NDC0409-2051-05 | Dose: 120mg/kg |
| xylazine | Lloyd Laboratories | LA33806 | Dose: 8mg/kg |
| atropine | Sigma-Aldrich | A0132 | (>98% purity); Dose: 0.2mg/kg – 20mg/kg |
| atropine | Voigt Global Distribution | AT105 | Pharmaceutical grade |
| Methoctramine | Sigma-Aldrich | M105 | Dose: 100 – 400M |
| 4-DAMP | Sigma-Aldrich | D142 | Dose: 2.5mg/kg |
| AFDX-116 | Tocris Bioscience | 1105 | 250M |
| AFDX-384 | Tocris Bioscience | 1345 | 50M – 500M |
| MT 7 | Peptides International | PMT-4340-s | 0.1M – 1M |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first by dissolving 10g/100mL de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| Sodium pentobarbitol | Virbac Animal Health | NDC-051311-050-01 | Dose: 390mg/kg |
| Sylgard | Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit, can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Use at concentration of 1:200 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Use at concentration of 1:1000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Use at concentration of 1:10 |
| S100 | Dako | Z0311 | Use at concentration of 1:400 |
| FITC- goat anti-mouse IgG1 | Roche | 03117731001 | Use at concentration of 1:200, but if background is high, try 1:400 |
| Alexa-Fluor 647 conjugated goat anti-rabbit | Invitrogen | A21244 | Use at concentration of 1:200 |
| Vectashield fluorescent mounting media | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set media, you will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 |
Riferimenti
- Wright, M. C., Son, Y. J. Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice. Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).
- Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).
- Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction. J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).
- Witzemann, V., Brenner, H. R., Sakmann, B. Neural factors regulate AChR subunit mRNAs at rat neuromuscular synapses. J Cell Biol. 114, 125-141 (1991).
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).
- Lanuza, M. A. Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase. C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).
- Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses. J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).
- Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin. J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).
- Wright, M. C. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
- Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors. J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).
- Dorje, F. Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes. J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).
- Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors. Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).
