Subkutan Muskarinik Antagonistleri Yönetim ve Farelerde levator Auris longus'un Triple-immün
Summary
Levator auris longus (LAL) genç erişkin farelerin kas muskarinik sinyalizasyon inhibitörleri tekrarlanan yönetim ve wholemounts nöromüsküler kavşak sonraki immün (NMJs) için prosedürleri açıklar. LAL kas ifşa ettiği için benzersiz avantajları vardır.<em> In vivo</em> NMJs farmakolojik etkileri.
Abstract
Gastroknemius ve tibialis anterior gibi kemirgenler, Hind bacak kasları memeli NMJs oluşumu ve korunması için gerekli sinyalleri in vivo farmakolojik çalışmalarda sık sık kullanılır . Ancak, subkutan veya intramusküler uygulamadan sonra bu kasların içine ilaç penetrasyonu genellikle eksik ya da düzensiz ve birçok NMJs etkilenmez. Mini pompaları gibi cihazlar ile sistemik yönetim Spatiotemporal etkilerini artırabilir olsa da, bu yaklaşımın invaziv doğası karıştırıcı inflamatuvar yanıtları ve / veya doğrudan kas hasarına neden olabilir. Ayrıca, zaman alıcı bir seri kesit ve kapsamlı immün gerektirdiğinden bir arka bacak kas NMJs tam analizi zordur.
Fare LAL boyun dorsum yüzeysel olarak bulunan ince bir kas, düz levha. Bu, hızlı kasılan kas fonksiyonları kulak kepçesi taşımak için. Kafatası orta hat kaynaklanan ve her kepçesi kıkırdak kısmının yanal uzatmak rostral ve kaudal kısımları içerir. Kas çıkar Stylomastoid foramen olarak kaudal projeler yüz sinirinin bir şube tarafından verilir. Biz ve diğerleri, hem de kısa ve uzun vadeli NMJs ve kasları ilaçların in vivo etkilerinin araştırılması için avantaj sunan uygun bir hazırlık olması amacıyla LAL bulduk . İlk olarak, yüzeysel bir konumda, hafif anestezi altında ilaçlar birden fazla yerel uygulamaları kolaylaştırır. İkincisi, inceliği (2-3 kat kas liflerinin), kas içinde hemen hemen tüm NMJs görselleştirme ve analiz izin verir. Üçüncü olarak, onun innervasyon deseni ile birlikte sinir bozulmadan diseksiyon kolaylığı, ek elektrofizyolojik analizi, di vitro 9,5 izin verir. Belki de son ve en önemlisi, uygulanan küçük bir hacim (~ 50μl) kolayca tüm kas yüzeyi kapsayan tüm NMJs ilaç düzgün ve uzun süreli maruz kalma sağlar ve sistemik bir yaklaşım 1,8 ihtiyacını ortadan kaldırır .
Protocol
Discussion
Burada sunulan yöntem memeli NMJs istikrar ve bakım sinyalizasyon alt tipi özel mAChR önceden tanınmayan rolleri soruşturma izin verir. Bu yöntem ayrıca nörotrofik faktörler ve farmakolojik ajanların etkilerini test etmek için faydalı olacaktır. Örneğin, laboratuar Silier Nörotrofik Faktör (CNTF) yetişkin farelerde neredeyse tüm LAL sinir terminallerinden çimlenme yol açtığını 1 . Bu sonuç ca az çimlenme orta bildirdi CNTF ile tedavi edilen arka bacak kasları, önceki çalışmalarla …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Müsküler Distrofi Derneği, NIH (NS062320) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| ketamine | Hospira | NDC0409-2051-05 | Dose: 120mg/kg |
| xylazine | Lloyd Laboratories | LA33806 | Dose: 8mg/kg |
| atropine | Sigma-Aldrich | A0132 | (>98% purity); Dose: 0.2mg/kg – 20mg/kg |
| atropine | Voigt Global Distribution | AT105 | Pharmaceutical grade |
| Methoctramine | Sigma-Aldrich | M105 | Dose: 100 – 400M |
| 4-DAMP | Sigma-Aldrich | D142 | Dose: 2.5mg/kg |
| AFDX-116 | Tocris Bioscience | 1105 | 250M |
| AFDX-384 | Tocris Bioscience | 1345 | 50M – 500M |
| MT 7 | Peptides International | PMT-4340-s | 0.1M – 1M |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first by dissolving 10g/100mL de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| Sodium pentobarbitol | Virbac Animal Health | NDC-051311-050-01 | Dose: 390mg/kg |
| Sylgard | Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit, can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Use at concentration of 1:200 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Use at concentration of 1:1000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Use at concentration of 1:10 |
| S100 | Dako | Z0311 | Use at concentration of 1:400 |
| FITC- goat anti-mouse IgG1 | Roche | 03117731001 | Use at concentration of 1:200, but if background is high, try 1:400 |
| Alexa-Fluor 647 conjugated goat anti-rabbit | Invitrogen | A21244 | Use at concentration of 1:200 |
| Vectashield fluorescent mounting media | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set media, you will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 |
Riferimenti
- Wright, M. C., Son, Y. J. Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice. Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).
- Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).
- Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction. J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).
- Witzemann, V., Brenner, H. R., Sakmann, B. Neural factors regulate AChR subunit mRNAs at rat neuromuscular synapses. J Cell Biol. 114, 125-141 (1991).
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).
- Lanuza, M. A. Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase. C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).
- Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses. J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).
- Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin. J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).
- Wright, M. C. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
- Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors. J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).
- Dorje, F. Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes. J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).
- Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors. Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).
