I neuroni vengono prima caratterizzata elettrofisiologico. Poi il citoplasma dal neurone registrato è aspirato e sottoposto a trascrizione inversa-PCR per rilevare l'espressione di mRNA per la sintesi degli enzimi dei neurotrasmettitori, canali ionici e recettori.
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Articolo metodologico
Profiling di potassio voltaggio-dipendenti espressione di mRNA nei neuroni Canale nigral con singola cella di RT-PCR Tecniche
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nel sistema nervoso centrale dei mammiferi, i diversi tipi di neuroni con diverse caratteristiche molecolari e funzionali sono mescolate tra loro, difficili da separare e anche non facilmente identificabili per la loro morfologia. Così, è spesso difficile analizzare l'espressione genica in un tipo specifico neurone. Qui documento di una procedura che combina a cellula intera tecniche di registrazione di patch clamp con cella singola invertire reazione a catena della polimerasi della trascrizione (SCRT-PCR) per profilo di espressione di mRNA in diversi tipi di neuroni nel nigra sostanziale. Tecniche elettrofisiologiche vengono prima utilizzate per registrare le proprietà neurofisiologiche e funzionali dei singoli neuroni. Poi, il citoplasma di singoli neuroni elettrofisiologico caratterizzato nigral è aspirato e sottoposto a SCRT-PCR per ottenere profili di espressione di mRNA per la sintesi degli enzimi dei neurotrasmettitori, recettori e canali ionici. L'elevata selettività e sensibilità rendono questo metodo particolarmente utile quando l'immunoistochimica non può essere utilizzata a causa della mancanza di anticorpi adatti o basso livello di espressione della proteina. Questo metodo è applicabile anche a neuroni in altre aree cerebrali.
Protocollo
1. Cervello fetta preparazione
- Giovani (15-40 giorni di età) maschili e femminili ratti Sprague-Dawley sono utilizzati. (Abbiamo anche utilizzare questo protocollo stesso nei topi.) Sotto anestesia uretano profondo, gli animali sono decapitati e il cervello è rapidamente sezionati fuori. Di 300 micron di spessore fette coronali del cervello che contiene la parte midrostral della substantia nigra sono tagliati su un vibratome Leica (VT-1200S). La fetta di taglio procedura viene eseguita in una gelida, saccarosio ossigenato di taglio soluzione contenente (in mm): 220 saccarosio, 2.5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 0,5 CaCl ....
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Discussione
La combinazione di registrazione patch clamp in fetta cervello con SCRT-PCR abbiamo dimostrato qui fornire un metodo eccellente per studiare i profili di espressione dell'mRNA per canali ionici, recettori ed enzimi chiave per la sintesi dei neurotrasmettitori in neuroni individualmente caratterizzato. Ciò è particolarmente utile quando la proteina in questione non può essere rilevato e localizzato utilizzando altri metodi, come l'immunoistochimica a causa di bassi livelli di espressione e / o mancanza di anticor.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni NIH R01DA021194 e R01NS058850.
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Materiali
Reagenti chiave Tabella 1. E attrezzature
Tabella 2. Paia Primer per neuronali di ratto KV3 canale, tirosina idrossilasi (TH) e acido glutammico decarbossilasi 1 (GAD1) mRNA per SCRT-PCR
Riferimenti
- J, Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and Kchip3.1 transcription. EMBO J. 20, 5715-5724 (2001).
- Surmeier, D. J., Song, W. J., Yan, Z. Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal medium spiny ne....
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Ristampe e permessi
