Une technique d'imagerie de fluorescence en direct à quantifier la reconstitution et la mobilisation des vésicules synaptiques spécifiques (SV) piscines dans les terminaisons nerveuses centrales est décrite. Deux séries de SV de recyclage sont suivis dans les terminaisons nerveuses offrant un contrôle interne.
Après la libération de neurotransmetteurs dans les terminaisons nerveuses centrales, SV sont rapidement récupérées par endocytose. Récupérée SV sont ensuite rechargées avec des neurotransmetteurs et de rejoindre la piscine de recyclage, défini comme les SV qui sont disponibles pour 1,2 exocytose. La piscine de recyclage peuvent être généralement divisées en deux poules distinctes – la piscine facilement libérable (PRR) et le pool de réserve (RP). Comme leur nom l'indique, le RRP se compose de SV qui sont immédiatement disponibles pour la fusion tandis RP SV sont libérés seulement pendant 1,2 stimulation intense. Il est important d'avoir un dosage fiable que les rapports différentiels de la reconstitution de ces piscines SV afin de comprendre 1) comment le trafic de SV après avoir différents modes d'endocytose (comme dépendante de la clathrine endocytose et l'activité endocytose dépendante de vrac) et 2) les mécanismes contrôle de la mobilisation à la fois du PRR et RP en réponse à différents stimuli.
Colorants FM sont systématiquement emploiented pour quantitativement le rapport chiffre d'affaires SV dans les terminaisons nerveuses centrales 3-8. Ils ont une queue hydrophobe qui permet d'hydrocarbures partitionnement réversible dans la bicouche lipidique, et un groupe de tête hydrophile qui bloque le passage à travers les membranes. Les colorants ont peu de fluorescence en solution aqueuse, mais leur rendement quantique augmente considérablement lorsque partitionné en membrane 9. Ainsi colorants FM sont idéales pour le suivi des sondes fluorescentes activement le recyclage SV. Le protocole standard pour l'utilisation de la FM colorant est comme suit. D'abord, ils sont appliqués aux neurones et sont repris au cours d'endocytose (figure 1). Après non internalisés colorant est lavé de la membrane plasmique, recyclés redistribuer SV au sein du pool de recyclage. Ces SV sont ensuite épuisés en utilisant des stimuli déchargement (figure 1). Depuis FM étiquetage des colorants SVS est quantiques 10, la chute de la fluorescence obtenue est proportionnelle à la quantité de vésicules libéré. Ainsi, le recyclage et la fusion de SV générés par le prrondes evious d'endocytose peuvent être quantifiés de manière fiable.
Ici, nous présentons un protocole qui a été modifié afin d'obtenir deux éléments d'information supplémentaires. Premièrement, le déchargement des stimuli séquentiels sont utilisés pour le déchargement de façon différentielle le RRP et le RP, afin de permettre la quantification de la reconstitution de certaines piscines SV. Deuxièmement, chaque terminaison nerveuse subit le protocole à deux reprises. Ainsi, la réponse du terminal même nerf au S1 peut être comparée à la présence d'une substance d'essai à la phase S2 (figure 2), fournissant un contrôle interne. Ceci est important, puisque l'étendue du recyclage SV travers les terminaisons nerveuses différentes est très variable 11.
Tout adhérent cultures neuronales primaires peuvent être utilisés pour ce protocole, mais la densité de placage, des solutions et des conditions de stimulation sont optimisés pour les neurones granulaires du cervelet (CGN) 12,13.
Colorants FM sont largement utilisées pour étudier la fonction terminaisons nerveuses dans de nombreuses préparations neuronales. Ils ont été principalement employés pour surveiller l'étendue de la SV soit endocytose, le chiffre d'affaires SV ou la cinétique d'exocytose 6. Le protocole décrit étend ces études afin d'examiner le différentiel de déchargement des piscines SV spécifiques. Cela fournit des informations supplémentaires concernant la reconstitution des piscines SV et aussi leur degré de mobilisation.
Colorants FM peut être utilisé pour l'étiquette de multiples séries de recyclage de SV au sein des terminaux même nerf. Nous avons exploité cette propriété et conçu des protocoles dans lesquels le chiffre d'affaires SV dans chaque terminal peut être contrôlé à deux reprises dans les bornes même nerf. Ceci fournit un contrôle précis interne, ce qui est essentiel en raison de la nature hétérogène du recyclage SV dans les terminaisons nerveuses parallèles 11. Via l'utilisation de la phase S1 comme un contrôle interne, le remplissage du PRR, RP et le totalPiscine SV dans la présence de drogues peut être fiable et directement comparés.
En plus de fournir des informations sur la taille absolue du recyclage, des piscines RRP et RP, dans des conditions de stimulation différents, ce protocole peut également fournir des données pour les suivants – 1) Le cloisonnement des SV entre le RRP et RP en fonction de la piscine de recyclage pour S1 et S2, 2) la taille relative des piscines S2 (RRP et RP) en fonction de la piscine de recyclage total S1 et 3) la taille relative de n'importe quelle piscine SV définie dans S2 en fonction de la piscine même en S1. Ce protocole particulier ne sera pas de fournir des informations sur la cinétique de déchargement cependant, puisque le temps d'acquisition est trop lent (pour les mesures cinétiques temps d'acquisition doit être aussi rapide que possible et au déchargement automatiquement synchronisées dans la capture d'image).
Nos 30 Hz 2 stimuli s évoque une mesure identique de RRP déchargement au saccharose hypertonique 8. Comme la taille du RRPest définie par le saccharose hypertonique de déchargement 15, nous pouvons affirmer que ce protocole décharge tous les VS RRP, en accord avec les études dans les neurones hippocampiques 16. Le pool de réserve est presque complètement épuisée par trois trains de 400 stimuli (40 Hz 10 s chacun) puisque cette stimulation décharge une quantité identique de teinture à un paradigme (2 stimuli avec 50 mM de KCl) qui épuise 95% de tous les colorants SV-étiquetés 8,17. La quantification précise de la taille à la fois du PRR et de la Réserve piscine est également dépendante de l'acquisition de l'information au sein de la gamme dynamique linéaire de la caméra CCD.
Ce protocole simple peut également être modifiée davantage. La force de stimuli de chargement peut également être modifiée afin de déterminer comment l'activité neuronale et des modes d'endocytose différentes affectent réapprovisionnement piscine SV. Par ailleurs, plus de deux cycles de chargement et le déchargement peut également être effectuée si nécessaire. Ce protocole peut aussi être utilisé dans les cellules transfectées avec surexpression ouvecteurs shRNA. En raison de la faible efficacité de transfection de cultures primaires de neurones, protéines exprimées doivent être étiquetés avec des protéines fluorescentes. Il est essentiel que ces balises fluorescentes ne pas interférer avec le signal FM colorant (ou protéines utilisent cyan rouge, par exemple). Dans ce cas, les terminaisons nerveuses des cellules transfectées et non transfectées dans le même champ de vision peuvent aussi être comparés en tant que contrôle supplémentaire 8. Dans les expériences d'une telle comparaison de l'étendue de chargement entre les charges S1 et S2 est de peu de valeur, puisque la perturbation est présente pendant les deux charges. Le partitionnement d'un colorant entre les pools de SV peut encore être visualisés Mais 8.
Journalistes génétique appelée pHluorins peut également être employé pour surveiller l'exocytose et l'endocytose SV dans la culture neuronale primaire. Ces sondes utilisent un pH-sensibles protéine fluorescente verte à l'environnement pH de domaines luminale des protéines étiquetées comme les SV VAMP, synaptophysine et VGLUT1 18 </sup>. Lorsqu'il est utilisé conjointement avec des inhibiteurs de l'ATPase vésiculaire, pHluorins peut signaler la fois la cinétique et l'ampleur de la mobilisation piscine SV 19. L'approche à base de colorants FM-décrite ici a quelques avantages sur la technique pHluorin, d'abord, les colorants FM fournir des informations sur le mode d'endocytose SV réapprovisionne le RRP et les piscines réserve 8. Deuxièmement spécifiques piscines SV peuvent être étiquetés avec des colorants FM qui ont différentes propriétés spectrales 20 et enfin il n'est pas nécessaire pour la transfection. Colorants FM ne peut pas fournir des informations sur le trafic entre la SV de repos et de recyclage des piscines SV cependant (contrairement à pHluorins 19), puisque par définition SV doivent être chargées avec un colorant lors de l'endocytose pour être visibles. Ainsi, les deux colorants FM et pHluorins ont des forces et faiblesses et sont plus puissants lorsqu'ils sont utilisés dans des expériences indépendantes pour traiter la même question.
Des images de haute qualité sont essentielles à l'analyse valides et reproducibLe résultat. Alors que la dérive horizontale peuvent être facilement corrigées, des expériences où il ya une dérive dans l'axe Z ne peuvent pas être récupérés. Pour cette raison, il est important de recentrer les images avant de commencer le déchargement S1 et S2. Dans les cas où une dégradation significative fluorescente a eu lieu, des corrections carie peut être appliquée (généralement en soustrayant une trace précédemment enregistré de FM-chargé cellules en l'absence de stimulation). Cependant, il est suggéré que la correction n'est effectuée que la carie de la représentation graphique et de ne pas être utilisé pour une analyse quantitative.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par une subvention du Wellcome Trust (Ref: 084277).
Name | Company | Catalogue no. |
---|---|---|
AxioCam MRm Rev. 3 Digital Camera | Carl Zeiss | 4265099901000 |
Axio Observer.A1 Microscope | Carl Zeiss | 4310040000000 |
Cell culture plates (6 wells) | Greiner bio-one | 657160 |
Centrifuge (Universal 32R) | Hettich Zentrifugen | 1610 |
CO2 incubator | Heraeus Instruments | 51014042 |
Falcon tubes (15/50 ml) | Greiner bio-one | 188271/210261 |
Fluar 20X /0.75 ∞/0.17 Objective | Carl Zeiss | 4401459901000 |
Glass coverslips (Ø25mm) | VWR international | 631-1584 |
Glass pasteur pipettes (230 nm) | Greiner bio-one | 612-1799 |
Haemocytometer | VWR | 15170-170 |
Imaging chamber | Warner | RC-21 BRFS |
Laminar flow hood | BIOHIT | VLF BHS 1200 |
McIlwain Tissue Chopper | Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd. | MTC/2 |
Mercury lamp | Carl Zeiss | HBO 103 |
MultiStim System Electrical Stimulator (100mV, 1ms pluse width) | Digitimer Ltd. | D330 |
Perfusion pump | Watson-Marlow | 313S |
Serological Pipettes (5/10/25 ml) | Greiner bio-one | 606180/607180/760180 |
Shutter controller | Carl Zeiss | MAC5000 |
Syringe (20 ml) | BD Plastipak | ST01-B002 |
Syringe Filters (Minisart – 0.20 μm) | Sartorius Stedim | 16532 |
VC-6 Six Channel valve controller | Warner | 64-0135 |
YFP Filter set (Set 46) | Carl Zeiss | 1196-681 |
Table 1. Specific equipment and apparatus used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
FM1-43 | Cambridge BioScience | BT70021 | 10 μM |
FM2-10 | Cambridge BioScience | BT70044 | 100 μM |
Poly-D-lysine | Sigma | P7886 | 15 μg/ml |
Silicone grease | Sigma | 85403 | – |
Table 2. Specific reagents used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | 0.3% |
D-Glucose | Sigma | G5767 | 0.25% |
MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | 1.5 mM |
D-PBS | Gibco | 21300 | 960 mg/100 ml |
-make 100ml fresh for each preparation
-sterile filter before use
Table 3. Solution B for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Solution B | – | – | 19 ml |
Trypsin (5 mg/ml stock, -20°C) | Sigma | T9201 | 1 ml |
Table 4. Solution T for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Solution C | – | – | 3.2 ml |
Solution B | – | – | 16.8 ml |
Table 5. Solution W for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Deoxyribonuclease (DNase, 500 U per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma | D5025 | 0.5 ml |
MgSO4· 7H2O | Sigma | M2773 | 1.5 mM |
Solution B | – | – | 10 ml |
Soybean trypsin inhibitor (SBTI, 0.5 mg per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma | T9003 | 0.5 ml |
Table 6. Solution C for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | 4% |
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco | 24010 | 10 ml |
MgSO4· 7H2O | Sigma | M2773 | 3 mM |
Table 7. EBSS Solution for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) * | Sigma | C1768 | 10 μM |
Foetal Bovine Serum | Gibco | 10106 | 10 % |
D-Glucose | Sigma | G5767 | 30 mM |
L-Glutamine | Sigma | G3126 | 2 mM |
KCl | Sigma | P5405 | 25 mM |
Minimal Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090 | 500 ml |
Penicillin (P)/Streptomycin (S) | Gibco | 15140 | 100 U/ml (P), 100 μg/ml (S) |
*Ara-C should be added to medium from 1 DIV onwards
Table 8. Culture Media for CGN preparation
Name | Version | Company |
---|---|---|
AxioVision Rel. | 4.8 | Carl Zeiss |
ImageJ | 1.42q | National Institutes of Health |
Microsoft Excel | 2003 | Microsoft |
Table 9. Specific computer software used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
CaCl2 · 2H2O | Sigma | C7902 | 1.3 mM |
Glucose | Sigma | G5767 | 5 mM |
KCl | Sigma | P5405 | 3.5 mM |
KH2PO4 | Sigma | P9791 | 0.4 mM |
MgCl2·6H2O | Sigma | M0250 | 1.2 mM |
NaCl | Fluka | 71378 | 170 mM |
NaHCO3 | Fluka | 71627 | 5 mM |
Na2SO4 | BDH Laboratory Supplies | 10264 | 1.2 mM |
TES | Sigma | T1375 | 20 mM |
Table 10. Saline Solution (pH 7.4)