중앙 신경 터미널에있는 보충 및 특정 시냅스 소포의 동원 (SV) 풀을 수치 라이브 형광 이미징 기술이 설명되어 있습니다. SV 재활용의 두 발만 내부 통제를 제공하는 동일한 신경 터미널에서 모니터링하고 있습니다.
중앙 신경 터미널에서 신경 전달 물질 릴리스 후, SVS는 신속하게 endocytosis에 의해 검색됩니다. 주소 SVS는 다음 신경 전달 물질과 리필 및 exocytosis 1,2 사용할 수 있습니다 SVS로 정의된 재활용 수영장, 다시 가입하고 있습니다. 쉽게 releasable 수영장 (RRP)와 예약 수영장 (RP) – 재활용 수영장은 일반적으로 별개의 두 수영장으로 세분화 될 수 있습니다. 그들의 이름이 암시로 RRP는 RP SVS는 강렬한 자극 1,2 동안에만 출시하는 동안 즉시 융합에 대해 사용할 수 있습니다 SVS로 구성되어 있습니다. 1) 이해하기 위해 이러한 SV 수영장의 차등 보충보고 신뢰성있는 분석을하는 것이 중요합니다 어떻게 SVS의 endocytosis의 다른 모드 이후 트래픽 (예 : clathrin 종속 endocytosis 및 활동에 의존 대량 endocytosis) 및 2) 메커니즘 다른 자극에 대한 응답으로 RRP와 RP 모두 동원을 조절.
FM의 염료는 정기적으로 채용 아르에드는 양적 중앙 신경 터미널에서 3-8 SV 매출액을보고합니다. 그들은 세포막에 걸쳐 지질 이중층에 가역 파티션을 허용 소수성 탄화 수소 꼬리와 친수성 머리 그룹 차단 통로 있습니다. 염료는 수용액에서 약간의 형광지만, 막 9 분할 때 자신의 양자 수율이 크게 증가합니다. 따라서 FM 염료 적극적으로 SVS를 재활용 추적에 이상적 형광 프로브입니다. 다음과 같은 FM 염료의 사용을위한 표준 프로토콜입니다. 먼저 그들은 뉴런에 적용되며 (그림 1) endocytosis 동안 촬영하고 있습니다. 비 내면 염료는 재활용 수영장 내에 플라즈마 막, 재활용 SVS의 재배 포할에서 씻겨 후. 이러한 SVS는 다음 하역 자극 (그림 1)를 사용 고갈됩니다. SVS의 FM 염료 라벨이 quantal 10 때문에, 결과 형광 드롭 출시 vesicles의 금액에 비례합니다. 따라서 SVS의 재활용과 융합은 PR에서 생성된endocytosis의 evious 라운드가 안정적으로 계량하실 수 있습니다.
여기, 우리는 정보의 두 개의 추가 요소를 얻기 위해 수정되었습니다 프로토콜을 제시한다. 첫째, 순차 하역 자극이 differentially 특정 SV 수영장의 보충의 부량 수 있도록, RRP와 RP를 언로 드하는 데 사용됩니다. 둘째, 각 신경 터미널 두 번 프로토콜을 겪습. 따라서, S1에서 동일한 신경 터미널의 반응은 내부 통제를 제공하고, S2 단계 (그림 2)에서 시험 물질의 존재에 대해 비교할 수 있습니다. 다른 신경 터미널 건너편 SV 재활용의 범위 11 높은 변수이기 때문에 이것은 중요합니다.
모든 자기편 기본의 연결을 문화가이 프로토콜을 사용할 수 있습니다 그러나 도금 밀도, 솔루션 및 자극 조건 소뇌 과립 뉴런 (CGNs) 12,13에 최적화되어 있습니다.
FM 염료가 광범위하게 많은의 연결 준비에 신경 터미널 기능을 조사하는 데 사용됩니다. 그들은 어느 SV의 endocytosis, SV 매출액 또는 exocytosis 6 반응 속도론의 범위를 모니터링하기 위해 주로 고용되어있다. 설명 프로토콜은 특정 SV 수영장의 하역 차등을 검토하는 연구를 확장합니다. 이것은 SV 수영장의 보충 또한 동원 자신의 범위에 관한 추가 정보를 제공합니다.
FM의 염료는 동일한 신경 터미널 내에 SV 재활용의 여러 라운드 레이블을 사용할 수 있습니다. 우리는 각 터미널에서 SV 회전율이 동일한 신경 터미널에 두번 모니터링할 수있는 프로토콜을이 속성을 이용하여 설계했습니다. 이것은 병렬로 인해 신경 터미널 11 SV 재활용의 이기종 자연 필수적이다 정확한 내부 통제를 제공합니다. 내부 통제로 S1 단계의 사용을 통해 RRP, RP 및 전체의 충진약물의 존재 SV 수영장은 안정과 직접적으로 비교할 수 있습니다.
재활용의 절대 크기의 정보를 제공하는 이외에, RRP와 RP 수영장 다른 자극 조건 하에서,이 프로토콜은 다음을위한 데이터를 제공할 수 – 1) 재활용 수영장의 함수로 RRP와 RP 사이 SVS의 파티션 S1과 S2, 2) 총 S1 재활용 수영장과 S1에서 같은 수영장의 함수로 S2에 정의된 SV 수영장 3) 상대적인 크기의 함수로 S2 수영장의 상대적 크기 (RRP와 RP). 인수 시간 (운동 측정을위한 수집 시간이 가능하고 이미지 캡처 동기화 자동으로 언로 드처럼 신속한한다) 너무 느린이기 때문에 이것은 특정 프로토콜 그러나 하역 속도론에 대한 정보를 제공하지 않습니다.
우리의 30 Hz에서 2 님의 자극은 hypertonic 자당 8 하역 RRP의 동일한 범위를 끝. RRP의 크기 때문에15 하역 hypertonic 자당에 의해 정의되고, 우리는 hippocampal 뉴런 16 연구와 계약에,이 프로토콜은 모든 RRP SVS를 언로 드되는 상태 수 있습니다. 예약 수영장은 거의 400 자극이 자극 때문에 (40 Hz에서 10의 각) 모든 염료로 분류 SVS의 95 %를 depletes 패러다임 (50 MM KCl 2 자극)에 염료의 동일한 금액을 언로 드 세 기차로 소진 8,17. RRP 및 보유 수영장 모두의 크기의 정확한 양을 정함 또한 CCD 카메라의 선형 동적 범위 내에서 정보를 취득에 따라 달라집니다.
이 간단한 프로토콜은 또한 더 이상 수정할 수 있습니다. 로딩 자극의 강도는 방법의 연결 활동 및 다른 endocytosis 모드는 SV 풀 보급에 영향을 결정하기 위해 다양한 수 있습니다. 필요한 경우 또한,로드 및 언로드보다보다 두 사이클도 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜은 overexpression 또는 중과 transfected 세포에도 사용할 수 있습니다shRNA 벡터. 기본의 연결을 문화의 낮은 transfection 효율로 인해, 표현 단백질은 형광 단백질 태그가 있어야합니다. 그것은이 형광 태그 (예를 들어, 시안이나 붉은 단백질을 사용) FM 염료 신호를 방해하지 않는 것이 중요합니다. 이 경우에는 볼 같은 분야에서 transfected 및 비 – transfected 세포에서 신경 터미널도 추가 제어 8로 비교할 수 있습니다. 섭동가 모두로드하는 동안 존재이기 때문에 이러한 실험에서 S1과 S2 사이의 하중 부하의 범위의 비교, 작은 가치입니다. SV 풀 사이에 염료 파티션 수는 있지만, 8 시각하실 수 있습니다.
유전자 기자 pHluorins도 기본의 연결을 문화 SV exocytosis와 endocytosis을 모니터 고용 수 있습니다했다. 이 프로브는 뱀파이어, synaptophysin 및 VGLUT1 18과 같은 태그 SV 단백질의 luminal 도메인의 산도 환경 산도에 민감한 녹색 형광 단백질을 사용하여 </suP>. 기공을 갖는 ATPase 억제제와 함께 사용하면, pHluorins는 SV 풀 동원 19 반응 속도론과 범위를 모두 보고할 수 있습니다. FM – 염료 기반의 접근 방식은 여기에서 설명한 것은 pHluorin 기술을 통해 몇 가지 이점을 가지고, 첫째, FM 염료는 SV의 endocytosis 모드 RRP 및 예약 풀 8 모아있는 정보를 제공합니다. 둘째 특정 SV 풀은 20 개의 다른 스펙트럼 특성을 가지고 있으며 마지막 transfection에 대한 요구가 없습니다 FM 염료로 분류하실 수 있습니다. 볼 수 있도록 endocytosis 동안 염료로로드해야 정의 SVS로부터 FM 염료는 휴식과 (pHluorins 19 대조적으로) 그러나 SV 풀을 재활용 사이의 SV 트래픽에 대한 정보를 제공할 수 없습니다. 따라서 FM 염료와 pHluorins 모두 강점과 약점을 가지고 있으며 같은 질문을 해결하기 위해 독립적인 실험에 이용했을 때 가장 강력한 있습니다.
고품질의 이미지는 유효한 분석과 reproducib에 필수적인르 결과입니다. 수평 드리프트가 쉽게 해결할 수 있지만, Z – 축에 표류이 실험은 복구할 수 없습니다. 이러한 이유로, S1과 S2 언로 드를 시작하기 전에 이미지를 다시 집중하는 것이 중요합니다. 중요한 형광 부패가 발생하는 경우에, 붕괴의 수정은 (일반적으로 자극의 부재에서 FM -로드 세포에서 이전에 기록된 추적을 빼서으로) 적용할 수 있습니다. 그러나, 그것은 감쇠 보정만이 어떠한 정량 분석을 위해 사용되는 그래픽 표현 및 없습니다 수행할 것을 권장합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 Wellcome 트러스트 (084277 참조)에서 부여에 의해 지원되었다.
Name | Company | Catalogue no. |
---|---|---|
AxioCam MRm Rev. 3 Digital Camera | Carl Zeiss | 4265099901000 |
Axio Observer.A1 Microscope | Carl Zeiss | 4310040000000 |
Cell culture plates (6 wells) | Greiner bio-one | 657160 |
Centrifuge (Universal 32R) | Hettich Zentrifugen | 1610 |
CO2 incubator | Heraeus Instruments | 51014042 |
Falcon tubes (15/50 ml) | Greiner bio-one | 188271/210261 |
Fluar 20X /0.75 ∞/0.17 Objective | Carl Zeiss | 4401459901000 |
Glass coverslips (Ø25mm) | VWR international | 631-1584 |
Glass pasteur pipettes (230 nm) | Greiner bio-one | 612-1799 |
Haemocytometer | VWR | 15170-170 |
Imaging chamber | Warner | RC-21 BRFS |
Laminar flow hood | BIOHIT | VLF BHS 1200 |
McIlwain Tissue Chopper | Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd. | MTC/2 |
Mercury lamp | Carl Zeiss | HBO 103 |
MultiStim System Electrical Stimulator (100mV, 1ms pluse width) | Digitimer Ltd. | D330 |
Perfusion pump | Watson-Marlow | 313S |
Serological Pipettes (5/10/25 ml) | Greiner bio-one | 606180/607180/760180 |
Shutter controller | Carl Zeiss | MAC5000 |
Syringe (20 ml) | BD Plastipak | ST01-B002 |
Syringe Filters (Minisart – 0.20 μm) | Sartorius Stedim | 16532 |
VC-6 Six Channel valve controller | Warner | 64-0135 |
YFP Filter set (Set 46) | Carl Zeiss | 1196-681 |
Table 1. Specific equipment and apparatus used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
FM1-43 | Cambridge BioScience | BT70021 | 10 μM |
FM2-10 | Cambridge BioScience | BT70044 | 100 μM |
Poly-D-lysine | Sigma | P7886 | 15 μg/ml |
Silicone grease | Sigma | 85403 | – |
Table 2. Specific reagents used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | 0.3% |
D-Glucose | Sigma | G5767 | 0.25% |
MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | 1.5 mM |
D-PBS | Gibco | 21300 | 960 mg/100 ml |
-make 100ml fresh for each preparation
-sterile filter before use
Table 3. Solution B for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Solution B | – | – | 19 ml |
Trypsin (5 mg/ml stock, -20°C) | Sigma | T9201 | 1 ml |
Table 4. Solution T for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Solution C | – | – | 3.2 ml |
Solution B | – | – | 16.8 ml |
Table 5. Solution W for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Deoxyribonuclease (DNase, 500 U per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma | D5025 | 0.5 ml |
MgSO4· 7H2O | Sigma | M2773 | 1.5 mM |
Solution B | – | – | 10 ml |
Soybean trypsin inhibitor (SBTI, 0.5 mg per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma | T9003 | 0.5 ml |
Table 6. Solution C for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | 4% |
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco | 24010 | 10 ml |
MgSO4· 7H2O | Sigma | M2773 | 3 mM |
Table 7. EBSS Solution for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) * | Sigma | C1768 | 10 μM |
Foetal Bovine Serum | Gibco | 10106 | 10 % |
D-Glucose | Sigma | G5767 | 30 mM |
L-Glutamine | Sigma | G3126 | 2 mM |
KCl | Sigma | P5405 | 25 mM |
Minimal Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090 | 500 ml |
Penicillin (P)/Streptomycin (S) | Gibco | 15140 | 100 U/ml (P), 100 μg/ml (S) |
*Ara-C should be added to medium from 1 DIV onwards
Table 8. Culture Media for CGN preparation
Name | Version | Company |
---|---|---|
AxioVision Rel. | 4.8 | Carl Zeiss |
ImageJ | 1.42q | National Institutes of Health |
Microsoft Excel | 2003 | Microsoft |
Table 9. Specific computer software used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
CaCl2 · 2H2O | Sigma | C7902 | 1.3 mM |
Glucose | Sigma | G5767 | 5 mM |
KCl | Sigma | P5405 | 3.5 mM |
KH2PO4 | Sigma | P9791 | 0.4 mM |
MgCl2·6H2O | Sigma | M0250 | 1.2 mM |
NaCl | Fluka | 71378 | 170 mM |
NaHCO3 | Fluka | 71627 | 5 mM |
Na2SO4 | BDH Laboratory Supplies | 10264 | 1.2 mM |
TES | Sigma | T1375 | 20 mM |
Table 10. Saline Solution (pH 7.4)