Et live fluorescens avbildningsteknikk å kvantifisere etterfylling og mobilisering av spesifikke synaptiske vesicle (SV) bassengene i sentral nerve terminaler er beskrevet. To runder med SV resirkulering overvåkes i samme nerveterminaler gir en intern kontroll.
Etter nevrotransmitter utgivelsen i det sentrale nerve terminaler, er SVS raskt hentes av endocytose. Hentet SVS blir deretter etterfylt med nevrotransmitter og slutte resirkulering bassenget, definert som SVS som er tilgjengelige for eksocytose 1,2. Resirkulering bassenget kan generelt deles inn i to forskjellige bassenger – den lett releasable pool (RRP) og reserve pool (RP). Som deres navn antyder, består RRP av SVS som er umiddelbart tilgjengelig for fusjon, mens RP SVS er utgitt bare under intens stimulering 1,2. Det er viktig å ha en pålitelig analyse som rapporterer differensial etterfylling av disse SV bassengene for å forstå 1) hvordan SVS trafikk etter forskjellige former for endocytose (som clathrin-avhengig endocytose og aktivitet-avhengige bulk endocytose) og 2) mekanismene kontrollere mobilisering av både RRP og RP som respons på ulike stimuli.
FM fargestoffer blir rutinemessig ansetteed å kvantitativt rapportere SV omsetning i sentrale nerveterminaler 3-8. De har en hydrofobe hydrokarbon hale som gjør at reversibel partisjonering i lipid bilayer, og en hydrofil hode gruppe som blokkerer passasjen over membraner. De fargene som har liten fluorescens i vandig løsning, men deres kvanteutbytte øker dramatisk når partisjonert i membran 9. Dermed FM fargestoffer er ideelle fluorescerende prober for sporing aktivt resirkulering SVS. Standard protokoll for bruk av FM fargestoff er som følger. Først de brukes til nevroner og blir tatt opp under endocytose (figur 1). Etter ikke-internalisert fargestoff er skylt vekk fra plasma membran, resirkulert SVS redistribuere innen resirkulering bassenget. Disse SVS er så utarmet bruker lossing stimuli (Figur 1). Siden FM dye merking av SVS er quantal 10, er den resulterende fluorescens slippe proporsjonal med mengden av vesikler utgitt. Dermed genererte resirkulering og sammensmeltingen av SVS fra previous runde av endocytose kan måles pålitelig kvantifisert.
Her presenterer vi en protokoll som har blitt endret for å få ytterligere to elementer av informasjon. For det første er sekvensielle lossing stimuli brukes for å differensielt losse RRP og RP, slik at kvantifisering av påfyll av spesifikke SV bassenger. Dernest gjennomgår hver nerve terminal protokollen to ganger. Dermed kan responsen av samme nerve terminalen på S1 bli sammenlignet mot tilstedeværelsen av en test stoffer på fase S2 (figur 2), som gir en intern kontroll. Dette er viktig, siden omfanget av SV gjenbruk på tvers av ulike nerveterminaler er svært variabel 11.
Enhver tilhenger primære neuronal kulturer kan brukes for denne protokollen, men plating tetthet, løsninger og stimulering forholdene er optimalisert for lillehjernen granule nevroner (CGNs) 12,13.
FM fargestoffer er mye brukt for å undersøke nerve terminal funksjon i mange neuronal forberedelser. De har vært ansatt i hovedsak til å overvåke omfanget av enten SV endocytose, SV omsetning eller kinetikken av eksocytose 6. De beskrevne Protokollen utvider disse studiene for å undersøke differensial lossing av spesifikke SV bassenger. Dette gir ytterligere informasjon om etterfylling av SV bassenger og også deres grad av mobilisering.
FM fargestoffer kan brukes til å merke flere runder med SV resirkulering innenfor samme nerveterminaler. Vi har utnyttet denne egenskapen og designet protokoller der SV omsetning i hver terminal kan overvåkes to ganger i samme nerveterminaler. Dette gir en nøyaktig intern kontroll, noe som er viktig på grunn av heterogene natur SV gjenvinning i parallell nerveterminaler 11. Via bruk av S1 fasen som en intern kontroll, påfylling av RRP, RP og den totaleSV bassenget i nærvær av narkotika kan være pålitelig og direkte sammenlignet.
I tillegg til å gi opplysninger av den absolutte størrelsen på resirkulering, RRP og RP bassenger under ulike stimulering forhold, kan denne protokollen også gi data for følgende – 1) oppdeling av SVS mellom RRP og RP som en funksjon av resirkulering bassenget for S1 og S2, 2) den relative størrelsen på S2 bassenger (RRP og RP) som en funksjon av total S1 resirkulering basseng og 3) den relative størrelsen på noen definert SV bassenget i S2 som en funksjon av det samme bassenget i S1. Dette bestemte protokollen vil ikke gi informasjon om lossing kinetikk men siden oppkjøpet tiden er for langsom (for kinetiske målinger innhentingstider bør være så rask som mulig og lossing automatisk synkronisert til Image Capture).
Våre 30 Hz 2 s stimuli fremkaller en identisk omfanget av RRP lossing til hyperton sukrose 8. Siden størrelsen på RRPer definert ved hyperton sakkarose lossing 15, kan vi konstatere at denne protokollen losser alle RRP SVS, i enighet med studier i hippocampus nevroner 16. Reservatet Bassenget er nesten helt utarmet av tre tog på 400 stimuli (40 Hz 10 s hver) siden dette stimulering losser en identisk mengde fargestoff til et paradigme (2 stimuli med 50 mM KCl) som depletes 95% av alle dye-merket SVS 8,17. Nøyaktig tallfesting av størrelsen på både RRP og reserve basseng er også avhengig av å skaffe opplysninger innen den lineære dynamiske området for CCD kameraet.
Denne enkle protokoll kan også endres ytterligere. Styrken til lasting stimuli kan også varieres for å avgjøre hvordan neuronal aktivitet og ulike endocytose moduser påvirke SV pool påfylling. Videre kan større enn to sykluser med lasting og lossing også utføres om nødvendig. Denne protokollen kan også brukes i celler transfektert med enten overekspresjon ellershRNA vektorer. På grunn av den lave transfeksjon effektiviteten av primær neuronal kulturer, må uttrykte proteiner merkes med fluorescerende proteiner. Det er viktig at disse fluoriserende kodene ikke forstyrre FM fargestoff signal (bruk cyan eller rød proteiner, for eksempel). I dette tilfellet kan nerveterminaler fra transfektert og ikke-transfektert celler i samme synsfelt også sammenliknes som en ekstra kontroll 8. I slike eksperimenter en sammenligning av omfanget av lasting mellom S1 og S2 last er av liten verdi, siden uro er til stede både under belastning. Partisjonering av fargestoff mellom SV bassenger fremdeles kan visualiseres imidlertid 8.
Genetisk reportere kalte pHluorins kan også være ansatt for å overvåke SV eksocytose og endocytose i grunnskolen neuronal kultur. Disse sondene bruker en pH-sensitiv grønt fluorescerende protein til pH miljøet luminal domener tagget SV proteiner som VAMP, synaptophysin og VGLUT1 18 </sup>. Når den brukes sammen med vesikulært ATPase-hemmere, kan pHluorins rapportere både kinetikk og omfanget av SV bassenget mobilisering 19. FM-dye baserte tilnærmingen som beskrives her har noen fordeler over pHluorin teknikk, det første FM fargestoffer gi informasjon om hvilke SV endocytose modus replenishes den RRP og reserve bassenger 8. Dernest spesifikke SV bassengene kan merkes med FM fargestoffer som har ulike spektrale egenskaper 20 og til slutt er det ingen krav til transfeksjon. FM fargestoffer kan ikke gi informasjon om SV trafikken mellom hvile og resirkulering SV bassenger imidlertid (i motsetning til pHluorins 19), da per definisjon SVS må være lastet med fargestoff under endocytose å være synlig. Dermed både FM fargestoffer og pHluorins har styrker og svakheter og er mest kraftig når brukt i uavhengige eksperimenter for å møte de samme spørsmål.
Bilder av høy kvalitet er avgjørende for gyldige analyse og reproducible resultater. Mens horisontale drift kan lett korrigeres, kan eksperimenter der det er drift i Z-aksen ikke gjenopprettes. Av denne grunn er det viktig å re-fokusere bilder før påbegynnes S1 og S2 losser. I tilfeller hvor en betydelig fluoriserende forfallet har skjedd, kan forfallet rettelser påføres (vanligvis ved å trekke et tidligere innspilt spor fra FM-loaded celler i fravær av stimulering). Imidlertid er det foreslått at forfallet korreksjon er bare utført for grafisk representasjon og ikke brukes for enhver kvantitativ analyse.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra Wellcome Trust (Ref: 084277).
Name | Company | Catalogue no. |
---|---|---|
AxioCam MRm Rev. 3 Digital Camera | Carl Zeiss | 4265099901000 |
Axio Observer.A1 Microscope | Carl Zeiss | 4310040000000 |
Cell culture plates (6 wells) | Greiner bio-one | 657160 |
Centrifuge (Universal 32R) | Hettich Zentrifugen | 1610 |
CO2 incubator | Heraeus Instruments | 51014042 |
Falcon tubes (15/50 ml) | Greiner bio-one | 188271/210261 |
Fluar 20X /0.75 ∞/0.17 Objective | Carl Zeiss | 4401459901000 |
Glass coverslips (Ø25mm) | VWR international | 631-1584 |
Glass pasteur pipettes (230 nm) | Greiner bio-one | 612-1799 |
Haemocytometer | VWR | 15170-170 |
Imaging chamber | Warner | RC-21 BRFS |
Laminar flow hood | BIOHIT | VLF BHS 1200 |
McIlwain Tissue Chopper | Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd. | MTC/2 |
Mercury lamp | Carl Zeiss | HBO 103 |
MultiStim System Electrical Stimulator (100mV, 1ms pluse width) | Digitimer Ltd. | D330 |
Perfusion pump | Watson-Marlow | 313S |
Serological Pipettes (5/10/25 ml) | Greiner bio-one | 606180/607180/760180 |
Shutter controller | Carl Zeiss | MAC5000 |
Syringe (20 ml) | BD Plastipak | ST01-B002 |
Syringe Filters (Minisart – 0.20 μm) | Sartorius Stedim | 16532 |
VC-6 Six Channel valve controller | Warner | 64-0135 |
YFP Filter set (Set 46) | Carl Zeiss | 1196-681 |
Table 1. Specific equipment and apparatus used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
FM1-43 | Cambridge BioScience | BT70021 | 10 μM |
FM2-10 | Cambridge BioScience | BT70044 | 100 μM |
Poly-D-lysine | Sigma | P7886 | 15 μg/ml |
Silicone grease | Sigma | 85403 | – |
Table 2. Specific reagents used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | 0.3% |
D-Glucose | Sigma | G5767 | 0.25% |
MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | 1.5 mM |
D-PBS | Gibco | 21300 | 960 mg/100 ml |
-make 100ml fresh for each preparation
-sterile filter before use
Table 3. Solution B for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Solution B | – | – | 19 ml |
Trypsin (5 mg/ml stock, -20°C) | Sigma | T9201 | 1 ml |
Table 4. Solution T for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Solution C | – | – | 3.2 ml |
Solution B | – | – | 16.8 ml |
Table 5. Solution W for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Deoxyribonuclease (DNase, 500 U per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma | D5025 | 0.5 ml |
MgSO4· 7H2O | Sigma | M2773 | 1.5 mM |
Solution B | – | – | 10 ml |
Soybean trypsin inhibitor (SBTI, 0.5 mg per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma | T9003 | 0.5 ml |
Table 6. Solution C for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | 4% |
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco | 24010 | 10 ml |
MgSO4· 7H2O | Sigma | M2773 | 3 mM |
Table 7. EBSS Solution for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) * | Sigma | C1768 | 10 μM |
Foetal Bovine Serum | Gibco | 10106 | 10 % |
D-Glucose | Sigma | G5767 | 30 mM |
L-Glutamine | Sigma | G3126 | 2 mM |
KCl | Sigma | P5405 | 25 mM |
Minimal Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090 | 500 ml |
Penicillin (P)/Streptomycin (S) | Gibco | 15140 | 100 U/ml (P), 100 μg/ml (S) |
*Ara-C should be added to medium from 1 DIV onwards
Table 8. Culture Media for CGN preparation
Name | Version | Company |
---|---|---|
AxioVision Rel. | 4.8 | Carl Zeiss |
ImageJ | 1.42q | National Institutes of Health |
Microsoft Excel | 2003 | Microsoft |
Table 9. Specific computer software used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
CaCl2 · 2H2O | Sigma | C7902 | 1.3 mM |
Glucose | Sigma | G5767 | 5 mM |
KCl | Sigma | P5405 | 3.5 mM |
KH2PO4 | Sigma | P9791 | 0.4 mM |
MgCl2·6H2O | Sigma | M0250 | 1.2 mM |
NaCl | Fluka | 71378 | 170 mM |
NaHCO3 | Fluka | 71627 | 5 mM |
Na2SO4 | BDH Laboratory Supplies | 10264 | 1.2 mM |
TES | Sigma | T1375 | 20 mM |
Table 10. Saline Solution (pH 7.4)